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アゴニストとアンタゴニストの非標的検出と分化、日用品のバイオプロファイルでの直接検出
Non-targeted detection and differentiation of agonists versus antagonists, directly in bioprofiles of everyday products.
PMID: 32674775 DOI: 10.1016/j.aca.2020.05.057.
抄録
Xenoestrogens は、ヒトのアンドロゲン受容体に抗アンドロゲン作用を及ぼします。分析分野では、そのような拮抗薬はテストステロンの検出をブロックし、合計パラメータアッセイで得られた結果を改ざんします。現在のところ、このようなアゴニスティック効果とアンタゴニスティック効果は、複雑な混合物では区別されていません。日常的に使用されている製品に存在する反対に作用するホルモン効果は、面倒な分画や個々の化合物の単離に加えて、各分画/化合物を現状維持のバイオアッセイ試験に供した後でなければ区別することができません。しかし、このような長時間にわたる手順はルーチンには適していません。そこで、複雑な混合物中のアゴニスト対アンタゴニストを直接測定する高速バイオ分析ツールを開発しました。具体的には、8種類の化粧品と15種類の感熱紙を分析しました。検出された活性化合物の拮抗電位は、既知の拮抗剤の拮抗電位と同等であった（参考までにビスフェノールA、4-ノニルフェノール、4種類のパラベンについて示した）。細胞生存率、培養条件、用量反応曲線、生物学的検出・定量限界、作業範囲（テストステロン、ジヒドロテストステロン、ナンドロロン、トレンボロン）などの関連する生物学的・クロマトグラフィーパラメータを調査し、生物学的検出の最高の感度を得た。開発した方法は、新たに逆相高速薄層クロマトグラフィープレーン酵母抗/拮抗アンドロゲンスクリーニング法（RP-HPTLC-pYAASバイオアッセイ）と命名した。また、RP-HPTLC-Aliibrio fischeriバイオアッセイ（RPプレートに初めて適用）との比較も行った。また、別のバイオアッセイ（RP-HPTLC-pYES）への移行が成功し、抗エストロゲンを検出するRP-HPTLC-pYAESバイオアッセイ（乳がん治療に使用される4つの医薬品の評価用に例示）が実証されました。この新しいイメージングコンセプトは、(1)バイオプロファイル中の個々のアゴニスティック効果とアンタゴニスティック効果の検出と分化、(2)スキャニングデンシトメトリーによる活性ポテンシャルの生物学的定量化、(3)ハイフネーションによる未知の生理活性化合物ゾーンの高分解能質量分析による特性評価を可能にします。ホルモンバイオアッセイに応じて、15個のサンプルを5時間または6時間以内（1サンプルあたり20分または24分として計算）に並行して分析した。酵母細胞への圧電スプレーを用いた平面的な酵母ベースのバイオアッセイに初めて成功した。
Xenoestrogens exert antiandrogenic effects on the human androgen receptor. In the analytical field, such antagonists block the detection of testosterone and falsify results obtained by sum parameter assays. Currently, such agonistic versus antagonistic effects are not differentiated in complex mixtures. Oppositely acting hormonal effects present in products of everyday use can only be differentiated after tedious fractionation and isolation of the individual compounds along with subjection of each fraction/compound to the status quo bioassay testing. However, such long-lasting procedures are not suited for routine. Hence, we developed a fast bioanalytical tool that figures out agonists versus antagonists directly in complex mixtures. Exemplarily, 8 cosmetics and 15 thermal papers were analyzed. The determined antagonistic potentials of active compounds found were comparable to the ones of known antagonists (in reference shown for bisphenol A, 4-n-nonylphenol and four parabens). Relevant biological/chromatographic parameters such as cell viability, culture conditions, dose response curves, limits of biological detection/quantification and working range (shown for testosterone, dihydrotestosterone, nandrolone and trenbolone) were investigated to obtain the best sensitivity of the biological detection. The developed and validated method was newly termed reversed phase high-performance thin-layer chromatography planar yeast ant-/agonistic androgen screen (RP-HPTLC-pYAAS bioassay). Results were also compared with the RP-HPTLC-Aliivibrio fischeri bioassay (applied on RP plates for the first time). As proof-of-concept, the transfer to another bioassay (RP-HPTLC-pYES) was successfully demonstrated, analogously termed RP-HPTLC-pYAES bioassay detecting anti-/estrogens (exemplarily shown for evaluation of 4 pharmaceuticals used in breast cancer treatment). The new imaging concept provides (1) detection and differentiation of individual agonistic versus antagonistic effects in the bioprofiles, (2) bioanalytical quantification of their activity potential by scanning densitometry and (3) characterization of unknown bioactive compound zones by hyphenation to high-resolution mass spectrometry. Depending on the hormonal bioassay, 15 samples were analyzed in parallel within 5 h or 6 h (calculated as 20 or 24 min per sample). For the first time, piezoelectric spraying of the yeast cells was successfully demonstrated for the planar yeast-based bioassays.
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