nanoDSF: ピコルナウイルスのコーティング解除と粒子の安定性に影響を与える化合物を監視するためのラベルフリー手法

nanoDSF: Label-Free Method to Monitor Picornavirus Uncoating and Test Compounds Affecting Particle Stability.

• Antonio Real-Hohn
• Martin Groznica
• Nadine Löffler
• Dieter Blaas
• Heinrich Kowalski

抄録

サーマルシフトアッセイは、高分子および高分子集合体の安定性を温度の関数として測定します。ピコルナウイルスの粒子安定性熱放出アッセイ（PaSTRy）は、タンパク質キャプシドの疎水性パッチ（例：SYPROオレンジ）またはウイルス粒子の加熱時に露出するウイルスRNAゲノム（例：SYTO-82）に結合することで強い蛍光を発するようになるプローブに基づいています。PaSTRyは、ウイルス変異体の安定性、ウイルスのアンコーティング、およびキャプシド安定化化合物の効果を研究するために利用されてきました。結果は通常ロバストであったが、SYPRO Orangeを用いたサーマルシフトアッセイは界面活性剤およびEDTAに敏感であり、少なくとも不活化ポリオウイルス3ワクチンに対する賦形剤の効果を正確に報告することはできなかった。さらに、プローブとキャピキシド結合抗ウイルス剤の間の相互作用、および結合部位の相互競争を排除することはできない。これらの問題点を克服するために、我々は、ラベルフリーの代替手段として、ナノDSF装置を用いた示差走査型蛍光光度法を評価した。ナノDSFは、温度の関数としてタンパク質の3次元構造の変化に起因する固有のトリプトファン蛍光（ITF）の変化をモニターする。ライノウイルスA2をモデルにして、nanoDFSが微量のサンプルでウイルスのコーティング解除に伴うコンフォメーション変化の温度依存性の記録に適していることを実証した。直交的な方法と比較し、ウイルスRNAの曝露量の増加とPaSTRy測定との相関を示した。重要なことは、nanoDSFは、ポケット結合型抗ウイルス化合物であるプレコナリルによるRV-A2の熱安定化を正確に同定したことである。このように、nanoDFSは、ウイルスの安定性に影響を与えるカプシド結合性化合物を発見するための、ラベルフリー、ハイスループット、カスタマイズ可能な魅力的な代替手段である。

Thermal shift assays measure the stability of macromolecules and macromolecular assemblies as a function of temperature. The Particle Stability Thermal Release Assay (PaSTRy) of picornaviruses is based on probes becoming strongly fluorescent upon binding to hydrophobic patches of the protein capsid (e.g., SYPRO Orange) or to the viral RNA genome (e.g., SYTO-82) that become exposed upon heating virus particles. PaSTRy has been exploited for studying the stability of viral mutants, viral uncoating, and the effect of capsid-stabilizing compounds. While the results were usually robust, the thermal shift assay with SYPRO Orange is sensitive to surfactants and EDTA and failed at least to correctly report the effect of excipients on an inactivated poliovirus 3 vaccine. Furthermore, interactions between the probe and capsid-binding antivirals as well as mutual competition for binding sites cannot be excluded. To overcome these caveats, we assessed differential scanning fluorimetry with a nanoDSF device as a label-free alternative. NanoDSF monitors the changes in the intrinsic tryptophan fluorescence (ITF) resulting from alterations of the 3D-structure of proteins as a function of the temperature. Using rhinovirus A2 as a model, we demonstrate that nanoDFS is well suited for recording the temperature-dependence of conformational changes associated with viral uncoating with minute amounts of sample. We compare it with orthogonal methods and correlate the increase in viral RNA exposure with PaSTRy measurements. Importantly, nanoDSF correctly identified the thermal stabilization of RV-A2 by pleconaril, a prototypic pocket-binding antiviral compound. NanoDFS is thus a label-free, high throughput-customizable, attractive alternative for the discovery of capsid-binding compounds impacting on viral stability.

Copyright © 2020 Real-Hohn, Groznica, Löffler, Blaas and Kowalski.