BMP、FGF、RAシグナル伝達経路の複合的な調節によるヒト人工多能性幹細胞の産婦人科リンパ節様細胞への濃縮分化の研究

Enrichment differentiation of human induced pluripotent stem cells into sinoatrial node-like cells by combined modulation of BMP, FGF, and RA signaling pathways.

• Feng Liu
• Yibing Fang
• Xiaojie Hou
• Ying Yan
• Haiying Xiao
• Dongchuan Zuo
• Jing Wen
• Linli Wang
• Zhichao Zhou
• Xitong Dang
• Rui Zhou
• Bin Liao

抄録

背景:

多能性幹細胞（PSC）を用いた生物学的ペースメーカーは、シックサイナス症候群の治療法として注目されている。そのため、生物学的ペースメーカーのための種細胞として、中胸腺結節様細胞（SANLC）を高効率で濃縮するための戦略を開発することが重要である。BMP, FGF, RA のシグナル伝達経路は、ペースメーカー細胞、心室細胞、心房細胞など、異なるサブタイプの心筋細胞の分化に関与していることが報告されている。我々は、BMP、FGF、RAシグナル伝達経路の複合的な調節が、SANLCのヒト多能性幹細胞（hiPSC）からの分化を豊かにするかどうかを調べることを目的としています。

BACKGROUND: Biological pacemakers derived from pluripotent stem cell (PSC) have been considered as a potential therapeutic surrogate for sick sinus syndrome. So it is essential to develop highly efficient strategies for enrichment of sinoatrial node-like cells (SANLCs) as seed cells for biological pacemakers. It has been reported that BMP, FGF, and RA signaling pathways are involved in specification of different cardiomyocyte subtypes, pacemaker, ventricular, and atrial cells. We aimed to investigate whether combined modulation of BMP, FGF, and RA signaling pathways could enrich the differentiation of SANLC from human pluripotent stem cell (hiPSC).

方法:

このSANLCの同定には、qRT-PCR、免疫蛍光、フローサイトメトリー、全細胞パッチクランプを用いた。

METHODS: During the differentiation process from human induced pluripotent stem cell to cardiomyocyte through small molecule-based temporal modulation of the Wnt signaling pathway, signaling of BMP, FGF, and RA was manipulated at cardiac mesoderm stage. qRT-PCR, immunofluorescence, flow cytometry, and whole cell patch clamp were used to identify the SANLC.

結果:

その結果、骨形態形成タンパク質（BMP）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、レチノイド酸（RA）の各シグナルを操作することで、SANLCマーカーのアップレギュレーションに有効であることが明らかになった。さらに、これら3つの経路の複合的な調節がSANLCマーカーの発現に最も効果的であることを示し、免疫蛍光およびフローサイトメトリーを用いてタンパク質レベルでの確認を行った。最後に、アップレギュレートされたSANLCの電気生理学的特性をパッチクランプ法で検証した。

RESULTS: qRT-PCR results showed that manipulating each one of bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF), and retinoid acid (RA) signaling was effective for the upregulation of SANLC markers. Moreover, combined modulation of these three pathways displayed the best efficiency for the expression of SANLC markers, which was further confirmed at protein level using immunofluorescence and flow cytometry. Finally, the electrophysiological characteristics of upregulated SANLC were verified by patch clamp method.

結論:

本研究では、BMP, FGF, RA シグナルを心臓中胚葉段階で複合的に調節することにより、高効率にSANLCを生成させることが可能であることを明らかにした。これは、生物学的ペースメーカー構築のためのアプローチの可能性を秘めている。

CONCLUSION: An efficient transgene-independent differentiation protocol for generating SANLC from hiPSC was developed, in which combined modulating BMP, FGF, and RA signaling at cardiac mesoderm stage generates SANLC at high efficiency. This may serve as a potential approach for biological pacemaker construction.