ヒト羊膜間葉系幹細胞は、アポトーシスと酸化ストレスを抑制することで、ブスルファン誘発性精巣毒性を有するマウスの精子形成を回復させる

Human amnion mesenchymal stem cells restore spermatogenesis in mice with busulfan-induced testis toxicity by inhibiting apoptosis and oxidative stress.

• Chunfeng Qian
• Qingxia Meng
• Jiafeng Lu
• Liya Zhang
• Hong Li
• Boxian Huang

抄録

背景:

性腺毒性治療を開始する前に、成熟精子の凍結保存は、男性の妊孕性を維持し、生殖補助技術（ART）で健康な赤ちゃんを妊娠させるための方法として世界的に提案されているが、思春期前の男児や精子形成不全の男性には、これらの技術は実行可能ではない。間葉系幹細胞の移植は、生殖腺移植片の血管新生、移植された細胞のクローン形成、障害された体細胞区画の回復を介して精子形成を回復させることに成功した治療上の利点を示している。本研究の目的は、ブスルファン誘発性精巣毒性に対するヒト羊膜間葉系幹細胞（hAMSC）の生殖能保護効果とその根底にあるメカニズムを解明することである。

BACKGROUND: Before starting gonadotoxic therapies, cryopreservation of mature sperm has been proposed worldwide as a method for male fertility preservation and for enabling the conception of a healthy baby with assisted reproductive technology (ART); however, these technologies are not feasible for prepubertal boys and men with spermatogenic failure. Transplantation of mesenchymal stem cells has exhibited successful therapeutic benefits in restoring spermatogenesis via gonadal graft angiogenesis, transplanted cell clonogenesis, and disordered somatic compartment recovery. This study aimed to elucidate the fertility protective effects and the underlying mechanisms of human amnion mesenchymal stem cells (hAMSCs) against busulfan-induced testis toxicity.

方法:

本研究では、男性の妊孕性維持に対するhAMSC移植の有効性とそのメカニズムを評価するために、in vivoのブスルファン誘発精巣毒性マウスモデルとin vitroのブスルファン投与マウスセルトリ細胞株を用いて検討した。精子形成の過程を組織学的に評価し、液胞を有する精液管の割合をHE染色で評価した。精液パラメータはコンピュータ支援精液分析により算出した。テストステロン濃度、酸化・抗酸化関連物質 LDH、MDA、GR、SOD、GPx、CAT を ELISA で測定した。増殖率（Ki67）、アポトーシス（アネキシンV）、活性酸素の割合をFACSで測定した。アポトーシスのマーカー（TUNEL）と精子形成における減数分裂遺伝子（SCP3）の蛍光強度を免疫蛍光アッセイにより検出した。生殖細胞特異的（GCS）遺伝子（Dazl、Ddx4、Miwi）および減数分裂遺伝子（Scp3、Cyclin A1、Stra8）のmRNAの発現をqPCRで調べた。抗アポトーシス蛋白質（SURVIVINおよびBCL2）、アポトーシス蛋白質（CASPASE3およびCASPASE9）、GCS蛋白質（Dazl、Ddx4およびMiwi）および減数分裂蛋白質（Scp3、Cyclin A1およびStra8）の発現をウエスタンブロット法により試験した。

METHODS: An in vivo busulfan-induced testis toxicity mouse model and an in vitro busulfan-administered mouse Sertoli cell line were employed to evaluate the efficacy and mechanisms of hAMSC transplantation on male fertility preservation. The process of spermatogenesis was evaluated histologically, and the percentage of seminiferous tubules with vacuoles was evaluated by HE staining. Semen parameters were calculated by computer-assisted semen analysis. ELISA was employed to test the testosterone concentration and the levels of oxidative- and antioxidative-associated substances LDH, MDA, GR, SOD, GPx, and CAT. The rates of proliferation (Ki67), apoptosis (Annexin V), and ROS were measured by FACS. The fluorescence intensity of a marker of apoptosis (TUNEL) and a meiosis gene in spermatogenesis (SCP3) were detected by immunofluorescence assay. The expression of mRNA in germ cell-specific (GCS) genes (Dazl, Ddx4, and Miwi) and meiosis genes (Scp3, Cyclin A1, and Stra8) was tested by qPCR. The expression of antiapoptotic proteins (SURVIVIN and BCL2), apoptotic proteins (CASPASE3 and CASPASE9), GCS proteins (Dazl, Ddx4, and Miwi), and meiosis proteins (Scp3, Cyclin A1, and Stra8) was tested by western blotting.

結果:

ブスルファン誘発性精巣毒性による精巣破壊後にhAMSCを移植すると、精子形成が回復し、テストステロンレベルが上昇し、in vivoでは精巣重量、サイズ、精液パラメータが向上した。さらに、hAMSCは明らかに細胞のアポトーシスを改善し、細胞増殖を促進し、酸化的損傷を抑制し、in vivoおよびin vitroで酸化的防御を増強した。さらに、hAMSCは、in vivoではGCS遺伝子Dazl、Ddx4、Miwi、減数分裂遺伝子Scp3、Cyclin A1、Stra8の発現を明確に増加させた。

RESULTS: hAMSC transplantation following disruption by busulfan-induced testis toxicity restored spermatogenesis, elevating testosterone levels and enhancing testicular weight, size, and semen parameters in vivo. In addition, hAMSCs clearly ameliorated cell apoptosis, enhanced cell proliferation, repressed oxidative damage, and augmented oxidative defense in vivo and in vitro. Moreover, hAMSCs distinctly increased the expression of the GCS genes Dazl, Ddx4, and Miwi and the meiosis genes Scp3, Cyclin A1, and Stra8 in vivo.

結論:

hAMSC は、ブスルファン誘発精巣毒性マウスモデルでは精子形成を回復させ、ブスルファン投与マウスセルトリ細胞株ではアポトーシスや酸化ストレスに抵抗して活性化を促進することから、再生医療への応用が期待されています。

CONCLUSIONS: hAMSCs might represent a promising tool for the use in regenerative medicine, as these cells can restore spermatogenesis in a busulfan-induced testis toxicity mouse model and facilitate activity in a busulfan-administered mouse Sertoli cell line by resisting apoptosis and oxidative stress.