活性化された第VIII因子に駆動された第IX因子の変化を水素-重水素eXchange質量分析法で調べた

Factor VIII-driven changes in activated Factor IX explored by Hydrogen-Deuterium eXchange Mass Spectrometry.

• Nadia Freato
• Eduard H T M Ebberink
• Josse van Galen
• Caroline Fribourg
• Mariëtte Boon-Spijker
• Floris van Alphen
• Alexander B Meijer
• Maartje van den Biggelaar
• Koen Mertens

抄録

酵素活性化第IX因子（FIXa）とその補因子である活性化第VIII因子（FVIIIa）の結合は、凝固カスケードにおいて重要なイベントである。酵素または補因子のいずれかの不在または機能不全は、止血を著しく悪化させ、血友病を引き起こす。FIXaは非効率な酵素であり、その止血力を駆動するためにはFVIIIaを必要とする。本研究では、水素-重水素交換質量分析法（HDX-MS）を用いて、リン脂質の存在下でFIXaがFVIIIaとの会合にどのように反応するかを調べた。その結果、活性部位誘導型阻害剤によって基質結合部位が占有されたときに生じる変化と部分的に重複する複雑なパターンの変化が明らかになった。HDX-MSは、補因子と基質の両方によって引き起こされる変化の中で、関連する凝固酵素のアロステリックネットワークに関与しているいくつかの表面ループを強調した。FVIIIa特異的な変化の検査は、3つのらせんがFIXa-FVIIIaアセンブリに関与していることを示した。これらは、エクサイトIIとしても知られている塩基性界面の一部である。ここに記載された塩基性残基の変異誘発、その後の機能研究は、確かにこの界面が拡張されたFVIIIa-相互作用パッチとして同定された。HDX-MSはまた、重度の血友病Bに関連する組換え型FIXa変異体にも適用された。我々は、HDX-MSは、疾患に関連した変異が止血系の酵素-因子複合体に及ぼす機能的影響を可視化する可能性があると結論付けた。

The assembly of the enzyme activated Factor IX (FIXa) with its cofactor, activated Factor VIII (FVIIIa) is a crucial event in the coagulation cascade. The absence or dysfunction of either enzyme or cofactor severely compromises hemostasis, and causes hemophilia. FIXa is a notoriously inefficient enzyme, and needs FVIIIa to drive its hemostatic potential, by a mechanism that has remained largely elusive to date. In this study we employed Hydrogen-Deuterium eXchange-Mass Spectrometry (HDX-MS) to investigate how FIXa responds to assembly with FVIIIa in presence of phospholipids. This revealed a complex pattern of changes that partially overlaps with those that occur upon occupation of the substrate-binding site by an active site-directed inhibitor. Among the changes driven by both cofactor and substrate, HDX-MS highlighted several surface loops that have been implicated in allosteric networks in related coagulation enzymes. Inspection of FVIIIa-specific changes indicated that three helices are involved in FIXa-FVIIIa assembly. These are part of a basic interface that is also known as Exosite II. Mutagenesis of basic residues herein, followed by functional studies, indeed identified this interface as an extended FVIIIa-interactive patch. HDX-MS was also applied to recombinant FIXa variants that are associated with severe hemophilia B. This revealed that single amino acid substitutions can silence the extended network of FVIIIa-driven allosteric changes. We conclude that HDX-MS has the potential to visualize the functional impact of disease-associated mutations on enzyme-cofactor complexes in the hemostatic system.

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