PARP酵素のターゲットエンゲージメントを研究するためのインビトロおよび細胞プローブ

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Cell Chem Biol.2020 Jul;27(7):877-887.e14. S2451-9456(20)30232-4. doi: 10.1016/j.chembiol.2020.06.009.

PARP酵素のターゲットエンゲージメントを研究するためのインビトロおよび細胞プローブ

In Vitro and Cellular Probes to Study PARP Enzyme Target Engagement.

Tim J Wigle
Danielle J Blackwell
Laurie B Schenkel
Yue Ren
W David Church
Hetvi J Desai
Kerren K Swinger
Andrew G Santospago
Christina R Majer
Alvin Z Lu
Mario Niepel
Nicholas R Perl
Melissa M Vasbinder
Heike Keilhack
Kevin W Kuntz

PMID: 32679093 DOI: 10.1016/j.chembiol.2020.06.009.

抄録

ポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）酵素は、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（NAD）を使用して、単一のモノ（ADP-リボース）単位で最大7つの異なるアミノ酸を修飾する（MARylation deposited by PARP monoenzymes）または分岐ポリ（ADP-リボース）ポリマー（PARylation deposited by PARP polyenzymes）。PARPモノ酵素およびポリ酵素のためのツール化合物の開発を可能にするために、我々は、NAD結合と競合する活性部位指向の阻害剤を特徴付けるために、インビトロおよび細胞生物物理学的アッセイで使用するための活性部位プローブを開発した。これらのアッセイは、各PARPのタンパク質基質に依存せず、これらの酵素の基質に関する一般的な知識の欠如を克服しています。インビトロアッセイでは、これまでに説明した活性アッセイよりも少ない酵素を使用しているため、一桁ナノモルの範囲で阻害剤の効力を識別することができ、細胞ベースのアッセイでは、サブナノモルの効力を持つ化合物を区別し、生きた細胞内での阻害剤の滞留時間を測定することができます。

Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) enzymes use nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to modify up to seven different amino acids with a single mono(ADP-ribose) unit (MARylation deposited by PARP monoenzymes) or branched poly(ADP-ribose) polymers (PARylation deposited by PARP polyenzymes). To enable the development of tool compounds for PARP monoenzymes and polyenzymes, we have developed active site probes for use in in vitro and cellular biophysical assays to characterize active site-directed inhibitors that compete for NAD binding. These assays are agnostic of the protein substrate for each PARP, overcoming a general lack of knowledge around the substrates for these enzymes. The in vitro assays use less enzyme than previously described activity assays, enabling discrimination of inhibitor potencies in the single-digit nanomolar range, and the cell-based assays can differentiate compounds with sub-nanomolar potencies and measure inhibitor residence time in live cells.