Ficoll 濃縮造精幹細胞の移植によるウズラ（Coturnix japonica）の生殖細胞キメラの生産

Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells.

• Jae Yong Han
• Ho Yeon Cho
• Young Min Kim
• Kyung Je Park
• Kyung Min Jung
• Jin Se Park

抄録

長期的な生殖細胞維持システムや効率的な生殖細胞導入方法がないため、ウズラにおける効果的なトランスジェニックシステムの開発は限られたものにとどまっていました。この限界を克服するために、我々はウズラへの生殖細胞導入のための実用的な方法として、Ficoll-Paque PLUS（Ficoll）、Percoll、スクロース溶液を用いた密度勾配法で濃縮された精巣幹細胞（SSC）を移植することにより、生殖細胞キメラウズラを作製した。いずれのグラジエント法においても、精巣細胞を２つの画分として分離し、SSC特異的遺伝子（GFRA1、ITGA6、ITGB1）および多能性遺伝子（NANOG、POUV）の発現レベルを調べた。その結果、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）およびRNAプローブハイブリダイゼーション解析の結果、Ficollで分離された上部画分は、全画分の中で最もSSC特異的遺伝子および多能性遺伝子の発現量が高いことが明らかになった。また、透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて分化した精巣で観察されたように、上部フィコール勾配画分の細胞はヘテロクロマチン分布の減少を示した。これらの結果は、フィコール密度勾配遠心分離によりSSCが上部画分に濃縮されていることを示している。その後の移植実験では、SSCを移植した生殖細胞キメラのドナー由来配偶子への生殖細胞伝達効率は、SSCが0-13.2％、精巣細胞全体が0-4.4％であることが明らかになった。これらの結果から、密度勾配法ではウズラのSSCが容易に濃縮され、この方法はウズラの生殖細胞を保存するための実行可能で実用的な方法であることが明らかになった。さらに、トランスジェニックウズラの生産や鳥類の保存を検討する研究への応用が期待されます。

Due to the absence of long-term in vitro germline competent stem cell maintenance systems and efficient methods for germline transmission, efforts to develop an effective transgenic system in quail has remained limited. To overcome this limitation, here we produced germline chimeric quails through transplantation of spermatogonial stem cells (SSCs) enriched by density gradient methods utilizing Ficoll-Paque PLUS (Ficoll), Percoll and sucrose solution as a practical strategy for germline transmission in quail. For all gradient methods, testicular cells were separated as two fractions, and the expression levels of SSC-specific genes (GFRA1, ITGA6, ITGB1) and pluripotency genes (NANOG, POUV) were examined. As a result, quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR) and RNA probe hybridization analysis revealed that the upper fraction that was separated by Ficoll showed the highest expression of SSC-specific and pluripotency genes among all fractions. Cells in the upper Ficoll gradient fraction also displayed reduced heterochromatin distribution, as observed in differentiated spermatogonia using transmission electron microscopy (TEM). These results indicate that SSCs were enriched in the upper fraction by Ficoll density gradient centrifugation. Subsequent transplantation experiments revealed that the efficiency of germline transmission to donor-derived gametes in the germline chimeras with transplanted SSCs and whole testicular cells was 0-13.2% and 0-4.4%, respectively. Collectively, these results demonstrate that quail SSCs were easily enriched with a density gradient method and that this method is a feasible and practical way to preserve the germplasm of quail. Furthermore, we can expect to apply this method in research examining the production of transgenic quail and preservation of avian species.

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