マウス脳内でのライブトラッキングのためのステルスプルロニックシェルを備えた超高輝度蛍光性高分子ナノ粒子

Ultrabright Fluorescent Polymeric Nanoparticles with Stealth Pluronic Shell for Live Tracking in Mouse Brain.

• Igor Khalin
• Doriane Heimburger
• Nina Melnychuk
• Mayeul Collot
• Bernhard Groschup
• Farida Hellal
• Andreas Reisch
• Nikolaus Plesnila
• Andrey S Klymchenko

抄録

単一有機ナノ粒子（NP）を生体内で可視化することは依然として課題であり、ナノメディシンの分野におけるボトルネックの理解を大幅に向上させる可能性があります。高い蛍光輝度を実現するために、我々はポリマーポリメタクリル酸メチルスルホン酸塩（PMMA-SO3H）ナノ粒子にオクタデシルローダミンBを担持し、蛍光体の凝集による消光を防ぐために、嵩高い疎水性対イオン（パーフルオロテトラフェニルホウ酸塩）を蛍光体絶縁体として担持しました。ステルス特性を持つNPを作成するために、我々は両親媒性ブロック共重合体であるプルロニックF-127とF-68を使用しました。蛍光相関分光法（FCS）とフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、プルロニクスが透析後のNP表面（5.5 nm2あたり1両親媒性で）に残っていることを明らかにし、血清タンパク質や界面活性剤との非特異的な相互作用からNPを防ぐことができました。初代培養ニューロンでは、プルロニクスは、その迅速な凝集とニューロンへの結合を防止するNPを安定化させた。20 wt%に色素の負荷を増加させ、粒子径を最適化することで、39nmの流体力学的直径の市販のナイルレッド負荷FluoSpheresTMと比較して、2光子励起で150倍高い単一粒子の明るさを示す74nmのNPが得られた。得られた超高輝度プルロニックコートNPは、非コートNPが急速に循環から排除されたのに対し、少なくとも1hのための2光子生体内顕微鏡によるマウスの脳の血管内の直接一粒子追跡を可能にした。血液脳関門を開くことができる脳損傷や神経炎症に続いて、NPsのextravasationを正常に監視することができました。さらに、我々は髄膜血管から髄膜マクロファージによる取り込みまで、個々のNPの追跡を実証した。このように、単一のNPは、異なる脳コンパートメントのin vivoでリアルタイムで動物に追跡することができ、それらのダイナミクスは、サブセルの解像度で可視化されています。

Visualizing single organic nanoparticles (NPs) in vivo remains a challenge, which could greatly improve our understanding of the bottlenecks in the field of nanomedicine. To achieve high single-particle fluorescence brightness, we loaded polymer poly(methyl methacrylate)-sulfonate (PMMA-SO3H) NPs with octadecyl rhodamine B together with a bulky hydrophobic counterion (perfluorinated tetraphenylborate) as a fluorophore insulator to prevent aggregation-caused quenching. To create NPs with stealth properties we used the amphiphilic block copolymers pluronic F-127 and F-68. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and Förster resonance energy transfer (FRET) revealed that pluronics remained at the NP surface after dialysis (at one amphiphile per 5.5 nm2) and prevented NPs from non-specific interactions with serum proteins and surfactants. In primary cultured neurons, pluronics stabilized the NPs preventing their prompt aggregation and binding to neurons. By increasing dye loading to 20 wt% and optimizing particle size, we obtained 74-nm NPs showing 150-fold higher single-particle brightness with two-photon excitation than commercial Nile Red-loaded FluoSpheresTM of 39-nm hydrodynamic diameter. The obtained ultrabright pluronic-coated NPs enabled direct single-particle tracking in vessels of mice brain by two-photon intravital microscopy for at least 1h, whereas non-coated NPs were rapidly eliminated from the circulation. Following brain injury or neuroinflammation, which can open the blood-brain barrier, extravasation of NPs was successfully monitored. Moreover, we demonstrated tracking of individual NPs from meningeal vessels until their uptake by meningeal macrophages. Thus, single NPs can be tracked in animals at real-time in vivo in different brain compartments and their dynamics visualized with subcellular resolution.