統合的ターゲティング法によるプロテアソーム遺伝子のヒトオルソログとの精密置換

Precise Replacement of Proteasome Genes with Human Orthologs by an Integrative Targeting Method.

• Christopher M Yellman

抄録

染色体の二本鎖切断を人為的に誘導すると、切断領域への相同 DNA 断片の統合頻度が最大で数桁向上します。相同修復のプロセスを利用して、原理的には、導入されたDNAの5'末端と3'末端の両方に二本鎖切断領域と相同な配列があれば、どのような外来DNAでも標的部位に統合することができます。私は、メガヌクレアーゼI-SceIを用いて二本鎖切断を染色体の標的部位に正確に誘導し、その部位での統合イベントを選択するためのツールを開発しました。この方法は、2つの異なるアプリケーションで検証されています。第一に、部位特異的な一塩基リン酸化部位変異の遺伝子への導入 第二に、11個のプロテアソーム遺伝子をそれらのヒトオルソログと正確に染色体置換する。このヒト遺伝子を転写制御下に置くことで、種を超えた機能的な遺伝子置換の理解を更新することができた。この経験は、ネイティブプロモーターを使用することが、ヒトにおける外来遺伝子の調整された発現のための有用な一般的な戦略である可能性を示唆している。

Artificial induction of a chromosomal double-strand break in enhances the frequency of integration of homologous DNA fragments into the broken region by up to several orders of magnitude. The process of homologous repair can be exploited to integrate, in principle, any foreign DNA into a target site, provided the introduced DNA is flanked at both the 5' and 3' ends by sequences homologous to the region surrounding the double-strand break. I have developed tools to precisely direct double-strand breaks to chromosomal target sites with the meganuclease I-SceI and select integration events at those sites. The method is validated in two different applications. First, the introduction of site-specific single-nucleotide phosphorylation site mutations into the gene Second, the precise chromosomal replacement of eleven proteasome genes with their human orthologs. Placing the human genes under transcriptional control allowed us to update our understanding of cross-species functional gene replacement. This experience suggests that using native promoters may be a useful general strategy for the coordinated expression of foreign genes in I provide an integrative targeting tool set that will facilitate a variety of precision genome engineering applications.

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