AZD5363とFH5363の組み合わせは、形質転換された肝細胞において致死的なオートファジーを誘導する

A combination of AZD5363 and FH5363 induces lethal autophagy in transformed hepatocytes.

• Tapas Patra
• Keith Meyer
• Ratna B Ray
• Ranjit Ray

抄録

肝細胞癌（HCC）は、世界的に癌関連死の主要な原因の一つである。高いAkt活性化と異常なβ-カテニン発現は、HCC細胞の増殖、幹細胞の生成、および転移に寄与している。いくつかのシグナル伝達経路特異的阻害剤が臨床試験中であり、HCCに対して異なる効果を示している。本研究では、β-カテニン阻害剤（FH535）が形質転換されたヒト肝細胞（THH）に対して抗増殖効果を示すことを確認した。その結果、FH535とAkt阻害剤(AZD5363)を併用することで、より強力な細胞死抑制効果を示した。THHをAZD5363とFH535で処理すると、細胞周期の進行が抑制され、オートファジーマーカー蛋白質の発現が増強され、オートファジー関連死が誘発されたのに対し、FH535処理のみではアポトーシスが誘発された。クロロキンまたはz-VADの使用は、これらの観察結果をさらに検証した。オートファジーフラックスは、マーカー蛋白質LAMP2、LAPTM4B、およびオートファジー蛋白質の発現を低下させることから、mCherry-EGFP-LC3レポーターコンストラクトを用いた共焦点顕微鏡検査で明らかになった。AZD5363とFH535を併用すると、MDM2の活性化を調節することでp53の発現が増強されたが、AZD5363単独ではダイナミン関連タンパク質の活性化を阻害することでp53は核内に制限された。核内のp53はAMPK-mTOR-ULK1経路を制御することでオートファジーの活性化に重要な役割を果たしている。ヌル p53 を有する Hep3B 細胞では、併用療法によるオートファジー依存性の死滅は抑制されなかった。以上の結果から、Akt阻害剤とβ-カテニン阻害剤の併用療法は、HCCに対する有効な治療法であることが強く示唆された。

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the major causes of cancer-related death worldwide. High Akt activation and aberrant β-catenin expression contribute to HCC cell proliferation, stem cell generation, and metastasis. Several signaling pathway-specific inhibitors are in clinical trials and display different efficacies against HCC. In this study, we observed that a β-catenin inhibitor (FH535) displays antiproliferative effect on transformed human hepatocytes (THH). A combination treatment of these cells with FH535 and Akt inhibitor (AZD5363) exerted a stronger effect on cell death. Treatment of THH with AZD5363 and FH535 inhibited cell-cycle progression, enhanced autophagy marker protein expression, and autophagy-associated death, while FH535 treatment alone induced apoptosis. The use of chloroquine or z-VAD further verified these observations. Autophagy flux was evident from lowering marker proteins LAMP2, LAPTM4B, and autophagic protein expression by confocal microscopy using mCherry-EGFP-LC3 reporter construct. A combination treatment with AZD5363 and FH535 enhanced p53 expression, by modulating MDM2 activation; however, AZD5363 treatment alone restricted p53 to the nucleus by inhibiting dynamin-related protein activation. Nuclear p53 plays a crucial role for activation of autophagy by regulating the AMPK-mTOR-ULK1 pathway. Hep3B cells with null p53 did not modulate autophagy-dependent death from combination treatment. Together, our results strongly suggested that a combination treatment of Akt and β-catenin inhibitors exhibits efficient therapeutic potential for HCC.