X精子のTLR7/8を活性化し、マウスやウシの胚を効率的に生産するための簡単な精子交配法

A simple sperm-sexing method that activates TLR7/8 on X sperm for the efficient production of sexed mouse or cattle embryos.

• Takashi Umehara
• Natsumi Tsujita
• Zhendong Zhu
• Moeka Ikedo
• Masayuki Shimada

抄録

家畜の好む性別は繁殖家によって異なります。例えば、酪農家は乳生産のためにメスの子牛を好むのに対し、牛の食肉生産者はオスを好むことが多いです。実験動物の交配は、生殖生物学や代謝研究など、いくつかの研究分野でも有益です。ほとんどのセクシング法では、セルソーターを用いてX精子とY精子を分離している。ここでは、TLR7/8リガンド（R848）で処理することでX精子とY精子を分離するシステムを説明します。このプロトコルは特別な装置や専門的な技術を必要としないため、体外受精（IVF）を行う研究室で容易に適用することができる。修正ヒト尿細管液（mHTF）培地1 mL（マウス精子）またはmHTF培地3 mL（雄牛精子）中に0.03μM R848を60分間処理した後、上層（マウス精子では400μL、雄牛精子では1 mL）と沈殿物を別々に採取します。各サンプルを遠心分離により洗浄した後、精子をリガンドフリーのIVF培地に懸濁させ、その後、IVFに使用することができる。上層精子を用いて作製された胚の90％以上はマウス、ウシともにXYであり、沈殿精子を用いて作製された胚の80％以上は両種ともにXXである。体外受精のためのX精子とY精子の分離は2時間以内に完了します。

The preferred sex of livestock differs among breeders; for example, dairy farmers prefer female calves for the production of milk, whereas cattle meat producers often prefer males. Sexing of laboratory animals is also beneficial in some research fields, including reproductive biology and metabolic studies. Most sexing methods separate X sperm and Y sperm with a cell sorter. Here, we describe a system in which treatment with the TLR7/8 ligand (R848) separates X sperm from Y sperm. Because this protocol does not require any special equipment or professional skills, it can be easily applied in laboratories where in vitro fertilization (IVF) is performed. The sperm are treated with 0.03 µM R848 in 1 mL of modified human tubal fluid (mHTF) medium (mouse sperm) or 3 mL of mHTF medium (bull sperm) for 60 min, and then the upper layer (400 µL in mouse sperm or 1 mL in bull sperm) and the precipitate are separately collected. After each sample is washed by centrifugation, the sperm are suspended in ligand-free IVF medium and can then be used for IVF. More than 90% of the embryos made with upper-layer sperm are XY in both mice and cattle, and >80% of the embryos made with precipitated sperm are XX in both species. Separation of X sperm and Y sperm for IVF can be completed within 2 h.