ヒト胚培養液および胚盤液中の可溶性RNAの包括的解析

Comprehensive analysis of soluble RNAs in human embryo culture media and blastocoel fluid.

• Kirstine Kirkegaard
• Yan Yan
• Boe S Sørensen
• Thorir Hardarson
• Charles Hanson
• Hans J Ingerslev
• Ulla Breth Knudsen
• Jørgen Kjems
• Kersti Lundin
• Aisling Ahlström

抄録

目的:

miRNAは胚の生存可能性のバイオマーカーとして示唆されているが、予備的な研究から得られた知見は異なっている。さらに、他の種類のsmall RNA分子の存在についても調査が必要である。本研究の目的は、使用済み胚培養液および無条件胚培養液中のsmall non-coding RNAレベルと、ヒト胚の胚盤胞液サンプル中のmiRNAレベルの包括的な解析を行うことであった。

PURPOSE: miRNAs have been suggested as biomarkers of embryo viability; however, findings from preliminary studies are divergent. Furthermore, the presence of other types of small RNA molecules remains to be investigated. The purpose of this study was to perform a comprehensive analysis of small non-coding RNA levels in spent and unconditioned embryo culture media, along with miRNA levels in blastocoelic fluid samples from human embryos.

方法:

3 種類のメーカーの無条件培地中の miRNA、5 日目の条件付き培地、対照培地、および 10 個のヒト胚盤胞からの対応する胚盤胞液中の miRNA を、アレイベースの q-PCR 解析で解析しました。その後、5 つのヒト胚盤胞および対応するコントロールから得られた 5 日目の使用済み培養液中の total RNA および small RNA のディープシーケンシングを行った。

METHODS: miRNAs in unconditioned culture medium from 3 different manufacturers, along with miRNA from day 5 conditioned culture medium, control medium, and corresponding blastocoel fluid from 10 human blastocysts were analyzed with array-based q-PCR analysis. Subsequently, deep sequencing of total and small RNA in day 5 spent culture medium from 5 human blastocysts and corresponding controls was performed.

結果:

最先端の感度の高い検出方法を用いたにもかかわらず、使用済み培養液または胚盤胞液中に確実に存在する miRNA は見出されなかった。アレイベースの分析では、C値が推奨される検出限界を超えていたが、これはディープシークエンシングによって確認された所見である。ディープシークエンシングによって同定されたmiRNAの大部分は、対照培地を含むすべてのサンプルで発現しており、条件付きIVF培地以外のソースに由来すると思われた。

RESULTS: In spite of using state-of-the-art sensitive detection methods, no miRNAs were found to be reliably present in the spent culture medium or the blastocoel fluid. C values were above the recommended limit for detection in the array-based analysis, a finding that was confirmed by deep sequencing. The majority of miRNAs identified by deep sequencing were expressed in all samples including control media and seem to originate from sources other than conditioned IVF media.

結論:

我々の知見は、信頼できるバイオマーカーとしてのmiRNAの使用に疑問を投げかけ、miRNA研究における重要な方法論的アプローチの必要性を強調している。興味深いことに、tiRNAフラグメントは、条件付き体外受精用培地サンプルで過剰発現しているようであり、調査に値する新しいバイオマーカーである可能性がある。

CONCLUSIONS: Our findings question the use of miRNAs as a reliable biomarker and highlight the need for a critical methodological approach in miRNA studies. Interestingly, tiRNA fragments appear to be overexpressed in conditioned IVF media samples and could potentially be a novel biomarker worthy of investigation.