インジゴイジン合成酵素BpsAは、他のNRPS酵素の基質嗜好性を定量するために適応させることができる比色ATPアッセイを提供します

The indigoidine synthetase BpsA provides a colorimetric ATP assay that can be adapted to quantify the substrate preferences of other NRPS enzymes.

• Alistair S Brown
• Mark J Calcott
• Vincent M Collins
• Jeremy G Owen
• David F Ackerley

抄録

目的:

青色素合成非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）BpsAに基づいてATPの比色アッセイを開発し、他のNRPS酵素の基質特異性を定義するために、その有用性を実証する。

OBJECTIVES: To develop a colorimetric assay for ATP based on the blue-pigment synthesising non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) BpsA, and to demonstrate its utility in defining the substrate specificity of other NRPS enzymes.

結果:

BpsAは、2分子のL-グルタミンを2分子のATPを消費しながら、2分子のL-グルタミンを検出しやすい青色色素であるインジゴイジンに変換することができます。我々は、この反応の化学量論が頑健であり、分光測光プレートリーダーを使用して、様々な媒体中の低マイクロモルレベルのATP濃度を正確に定量するために、マイクロプレート形式で実行できることを示した。また、好ましい基質の存在下でATPの消費を駆動するためにピロホスファターゼ酵素を追加することにより、アッセイがNRPSアデニル化ドメインのアミノ酸基質の嗜好性を評価するために適応できることを実証した。

RESULTS: BpsA is able to convert two molecules of L-glutamine into the readily-detected blue pigment indigoidine, consuming two molecules of ATP in the process. We showed that the stoichiometry of this reaction is robust and that it can be performed in a microplate format to accurately quantify ATP concentrations to low micromolar levels in a variety of media, using a spectrophotometric plate-reader. We also demonstrated that the assay can be adapted to evaluate the amino acid substrate preferences of NRPS adenylation domains, by adding pyrophosphatase enzyme to drive consumption of ATP in the presence of the preferred substrate.

結論:

反応プロトコルの堅牢性とシンプルさは、ATP定量とNRPS基質分析のための既存の方法よりも利点を提供しています。

CONCLUSIONS: The robust nature and simplicity of the reaction protocol offers advantages over existing methods for ATP quantification and NRPS substrate analysis.