ユニークに結合する繰り返しDNAプローブを用いたCOMBinatorial Oligonucleotide FISH（COMBO-FISH）

COMBinatorial Oligonucleotide FISH (COMBO-FISH) with Uniquely Binding Repetitive DNA Probes.

• Michael Hausmann
• Jin-Ho Lee
• Aaron Sievers
• Matthias Krufczik
• Georg Hildenbrand

抄録

この10年間で、多くの種のゲノム配列データベースが完成し、COMBO-FISH（COMBinatorial Oligo FISH）と呼ばれる最近確立されたFISH（Fluorescence In Situ Hybridization）の技術をさらに発展させることが可能になってきました。標準的なFISH手法とは異なり、COMBO-FISHは配列データベースのバイオインフォマティクス検索をプローブ設計に利用しているため、これまでに配列決定されたあらゆる種に対してプローブ設計を行うことができます。オリジナルのアプローチでは、15〜30ヌクレオチドの典型的な長さのオリゴヌクレオチドが、与えられたゲノムターゲットにのみ共局在するように選択されています。約２０〜４０本のストレッチャーの典型的なプローブセットは、約５０〜２５０ｋｂを特異的に標識するために使用された。異なる長さのプローブは、プリンおよびピリミジンから構成され得るが、標的鎖の変性およびプローブの三本鎖結合を省略したプロトコルを使用することの実験的利点のために、ホモプリンまたはホモピリミジンプローブセットに制限されることが多かった。これは、ゲノムの3次元フォールディングと配列のより良い保存を可能にします。改良された厳密なゲノム配列データベースの解析と統計的頻度と一意性に従った配列検索により、SINEs（Short Interspersed Nuclear Elements、例：ALU element）、LINEs（Long Interspersed Nuclear Elements、例：L1）、またはセントロメアのような特徴的なゲノムの特徴に繰り返し結合するプローブの新しいファミリーが開発されました。これらのプローブは、高純度で、蛍光色素分子によって標識されたＤＮＡプローブまたはＰＮＡプローブとして市販されているものを合成することができる。ここでは、新しいプロトコルは、オリゴヌクレオチド標識も特異的な抗体による免疫染色と組み合わせることができるように、ターゲットの変性のための熱処理を省略したプリンピリミジンプローブのために記載されています。オリゴヌクレオチドの伸張にリンクされた色素が可逆的な光ブリーチング（レーザー誘導遅い点滅）を経る場合、標識された細胞核は、さらに複雑なクロマチンアーキテクチャの研究のための超解像局在顕微鏡に服従させることができる。

During the last decade, genome sequence databases of many species have been more and more completed so that it has become possible to further develop a recently established technique of FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) called COMBO-FISH (COMBinatorial Oligo FISH). In contrast to standard FISH techniques, COMBO-FISH makes use of a bioinformatic search in sequence databases for probe design, so that it can be done for any species so far sequenced. In the original approach, oligonucleotide stretches of typical lengths of 15-30 nucleotides were selected in such a way that they only co-localize at the given genome target. Typical probe sets of about 20-40 stretches were used to label about 50-250 kb specifically. The probes of different lengths can be composed of purines and pyrimidines, but were often restricted to homo-purine or homo-pyrimidine probe sets because of the experimental advantage of using a protocol omitting denaturation of the target strand and triple strand binding of the probes. This allows for a better conservation of the 3D folding and arrangement of the genome. With an improved, rigorous genome sequence database analysis and sequence search according to statistical frequency and uniqueness, a novel family of probes repetitively binding to characteristic genome features like SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements, e.g., ALU elements), LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements, e.g., L1), or centromeres has been developed. These probes can be synthesized commercially as DNA or PNA probes with high purity and labeled by fluorescent dye molecules. Here, new protocols are described for purine-pyrimidine probes omitting heat treatment for denaturation of the target so that oligonucleotide labeling can also be combined with immune-staining by specific antibodies. If the dyes linked to the oligonucleotide stretches undergo reversible photo-bleaching (laser-induced slow blinking), the labeled cell nuclei can be further subjected to super-resolution localization microscopy for complex chromatin architecture research.