ホロトモグラフィー顕微鏡。アポトーシス細胞の特徴を検出するための新しいアプローチ

Holotomographic microscopy: A new approach to detect apoptotic cell features.

• Sara Salucci
• Michela Battistelli
• Sabrina Burattini
• Francesca Sbrana
• Elisabetta Falcieri

抄録

ホロトモグラフィー(HT)顕微鏡法は、ホログラフィーとトモグラフィーの2つの技術を組み合わせたもので、3次元(3D)画像を取得したり、内部の形態変化をモニターしたりすることで、細胞や薄い組織のスライスを定量的かつ非侵襲的に調べることができます。HTは、ラベルフリーであることと、低エネルギーの光が最小限の摂動で試料を通過するという2つの大きな利点を持っています。また、光回折トモグラフィーを用いた定量的な位相イメージングを用いることで、屈折率（RI）を測定することで3次元画像を作成することができます。そのため、RI値に基づいて、乾燥質量値や形態変化、細胞膜の動態など、細胞の構造や化学的な情報を提供することができます。本研究では、懸濁培養細胞及び付着培養細胞をHT分析のために処理した。これらの細胞の中には、既知のアポトーシス薬やプロオキシダントで処理したものもあり、細胞応答を従来の顕微鏡的アプローチとHTの両方で調べた。超微細構造と蛍光画像をHTで得られたものと比較し、アポトーシス細胞死と相関する細胞膜の変化に特に注意を払いながら、それらの一致性について議論した。HTは、細胞の出血、クロマチン凝縮、小核、アポトーシス小体などのよく知られているアポトーシスの特徴をさらに特徴づけるために有効なアプローチであると思われる。これらのデータを総合すると、我々のデータは、異なる条件下での浮遊細胞や付着細胞の挙動を強調するのに適していることを示している。特に、この技術は、健康な細胞とアポトーシスを区別するための重要な新しいツールであり、また、非侵襲的でラベルフリーのアプローチで、外側と内側の細胞の変化を迅速にモニターするための重要なツールであると思われる。

Holotomographic (HT) microscopy, combines two techniques, holography and tomography, and, in this way, it allows to quantitatively and noninvasively investigate cells and thin tissue slices, by obtaining three-dimensional (3D) images and by monitoring inner morphological changes. HT has indeed two significant advantages: it is label-free and low-energy light passes through the specimen with minimal perturbation. Using quantitative phase imaging with optical diffraction tomography, it can produce 3D images by measuring the refraction index (RI). Therefore, based on RI values, HT can provide structural and chemical cell information, such as dry mass values, morphological changes, or cellular membrane dynamics. In this study, suspended and adherent culture cells have been processed for HT analyses. Some of them have been treated with known apoptotic drugs or pro-oxidant agents and cell response has been investigated both by conventional microscopic approaches and by HT. The ultrastructural and fluorescence images have been compared to those obtained by HT and their congruence has been discussed, with particular attention to apoptotic cell death and on correlated plasma membrane changes. HT appears a valid approach to further characterize well-known apoptotic features such as cell blebbing, chromatin condensation, micronuclei, and apoptotic bodies. Taken together, our data demonstrate that HT appears suitable to highlight suspended or adherent cell behavior under different conditions. In particular, this technique appears an important new tool to distinguish healthy cells from the apoptotic ones, as well as to monitor outer and inner cell changes in a rapid way and with a noninvasive, label-free, approach.

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