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腫瘍治療に応用可能な標的ウイルスタンパク質である可溶性で安定なアポプチン-EGF融合タンパク質の作製
Generation of a soluble and stable apoptin-EGF fusion protein, a targeted viral protein applicable for tumor therapy.
PMID: 32681952 DOI: 10.1016/j.pep.2020.105687.
抄録
腫瘍を標的とした毒素の有望な候補として、腫瘍特異的なアポトーシスを誘導するニワトリ貧血由来の蛋白質アポチンがある。本研究では、大腸菌を発現宿主とし、アポチンと腫瘍誘導リガンドである上皮成長因子（EGF）を遺伝子融合させることで、アポチンを標的とした新規な毒素を設計することを目指した。しかし、アポプチンは疎水性が高く、不溶性の凝集体を形成する傾向がある。そのため、3種類の異なるアポチン-EGFバリアントが生成された。融合タンパク質ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）-アポプチン-ＥＧＦ（ＨＡＥ）を大腸菌で発現させ、包接体による変性条件下で精製した。蛋白質の溶解性は、マルトース結合蛋白質（MBP）またはグルタチオンS-トランスフェラーゼにより改善された。MBP-アポプチン-EGF（MAEH）は、最終収量（4-6 mg/L）と安定性の点で、標的毒素として好ましいことがわかった。MBPは凝固因子Xaを用いて酵素的に除去されたが、収率が低く分離が悪かった。MAEHを標的細胞株および非標的細胞株で試験した。標的腫瘍細胞株A431は、MAEHとのインキュベーション時のICが69.55nMで有意な毒性を示したが、線維芽細胞や標的受容体を持たない細胞は影響を受けなかった。本研究では、高収率、高純度、高安定性を有する新規EGF受容体標的薬を設計した。
A promising candidate for tumor targeted toxins is the chicken anemia-derived protein apoptin that induces tumor-specific apoptosis. It was aimed to design a novel apoptin-based targeted toxin by genetic fusion of apoptin with the tumor-directed ligand epidermal growth factor (EGF) using Escherichia coli as expression host. However, apoptin is highly hydrophobic and tends to form insoluble aggregates. Therefore, three different apoptin-EGF variants were generated. The fusion protein hexa-histidine (His)-apoptin-EGF (HAE) was expressed in E. coli and purified under denaturing conditions due to inclusion bodies. The protein solubility was improved by maltose-binding protein (MBP) or glutathione S-transferase. The protein MBP-apoptin-EGF (MAEH) was found favorable as a targeted toxin regarding final yield (4-6 mg/L) and stability. MBP was enzymatically removed using clotting factor Xa, which resulted in low yield and poor separation. MAEH was tested on target and non-target cell lines. The targeted tumor cell line A431 showed significant toxicity with an IC of 69.55 nM upon incubation with MAEH while fibroblasts and target receptor-free cells remained unaffected. Here we designed a novel EGF receptor targeting drug with high yield, purity and stability.
Copyright © 2020. Published by Elsevier Inc.