ヘリコバクター・ピロリからの生物学的に活性な組換えVacAサイトトキシンバリアントの最適化された高純度タンパク質の調製

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Protein Expr. Purif..2020 Jul;:105696. S1046-5928(20)30287-4. doi: 10.1016/j.pep.2020.105696.Epub 2020-07-15.

ヘリコバクター・ピロリからの生物学的に活性な組換えVacAサイトトキシンバリアントの最適化された高純度タンパク質の調製

Optimized high-purity protein preparation of biologically active recombinant VacA cytotoxin variants from Helicobacter pylori.

Aung Khine Linn
Nitchakan Samainukul
Hui-Chun Li
Chanan Angsuthanasombat
Gerd Katzenmeier

PMID: 32681955 DOI: 10.1016/j.pep.2020.105696.

抄録

ウイルス性サイトトキシンA（Vacuolating cytotoxin A、VacA）は、胃炎、消化性潰瘍、胃癌の原因となるヒト胃病原体ヘリコバクター・ピロリによって産生される高多型のウイルス性タンパク質である。本研究では、成熟した完全長VacA変異体（m1型およびm2型）とその33kDaのN末端ドメインおよび55/59kDaのC末端ドメインを、N末端Hisタグと融合させた生物学的に活性な組換えタンパク質として最適化したタンパク質の調製法を紹介する。VacAは、リン酸緩衝液（pH7.4）に5-6Mの尿素を加えることで可溶化し、大腸菌で過剰発現した。5-M尿素変性条件下で固定化-Ni親和性精製を行ったところ、55/59-kDaドメインのホモジナイズ産物（純度95％以上）が得られたが、成熟したVacAバリアントと33-kDaトランケートの純度は約80％にとどまり、サイズ排除クロマトグラフィーによる追加精製が必要であった。最適化されたステップワイズ透析を介して連続的にリフォールディングした後、すべてのリフォールディングされたVacAタンパク質は、VacA-m2で観察された活性はm1型バリアントよりも低かったにもかかわらず、培養ヒト胃上皮細胞に対して細胞毒性および真空胞化活性の両方を有することが証明された。このような最適化されたプロトコールは、高純度の組換えVacAタンパク質を大量に生産するのに有効であった（１リットル培養あたり約３０〜４０ｍｇ）。

Vacuolating cytotoxin A (VacA) is a highly polymorphic virulence protein produced by the human gastric pathogen Helicobacter pylori which can cause gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. Here, we present an optimized protein preparation of the mature full-length VacA variants (m1-and m2-types) and their 33-kDa N-terminal and 55/59-kDa C-terminal domains as biologically active recombinant proteins fused with an N-terminal His tag. All recombinant VacA constructs were over-expressed in Escherichia coli as insoluble inclusions which were soluble when phosphate buffer (pH 7.4) was supplemented with 5-6 M urea. Upon immobilized-Ni affinity purification under 5-M urea denaturing conditions, homogenous products (>95% purity) of 55/59-kDa domains were consistently obtained while only ∼80% purity of both mature VacA variants and the 33-kDa truncate was achieved, thus requiring additional purification by size-exclusion chromatography. After successive refolding via optimized stepwise dialysis, all refolded VacA proteins were proven to possess both cytotoxic and vacuolating activity against cultured human gastric epithelial cells albeit the activity observed for VacA-m2 was lower than the m1-type variant. Such an optimized protocol described herein was effective for production of high-purity recombinant VacA proteins in large amounts (∼30-40 mg per liter culture) that would pave the way for further studies on sequence-structure and function relationships of different VacA variants.