Dazlの抑制はヒト神経膠芽腫細胞の腫瘍性と幹細胞性を調節する

Suppressing Dazl modulates tumorigenicity and stemness in human glioblastoma cells.

• Fengyu Zhang
• Ruilai Liu
• Haishi Zhang
• Cheng Liu
• Chunfang Liu
• Yuan Lu

抄録

背景:

膠芽腫は発生頻度が高く、生存率が低い壊滅的な癌であり、治療のための新規膠芽腫特異的抗原の発見が急務である。がんの生殖細胞遺伝子は、腫瘍化を促進することで、いくつかのがんの形成や進行に関係していることが知られています。Dazlはそのような生殖細胞遺伝子の一つであり、いくつかの生殖細胞癌でアップレギュレーションされている。本研究では、ヒト神経膠芽腫組織・細胞における Dazl の発現を解析し、神経膠芽腫細胞株の増殖、遊走、浸潤、化学抵抗性における Dazl の意義を検討した。

BACKGROUND: Glioblastoma is devastating cancer with a high frequency of occurrence and poor survival rate and it is urgent to discover novel glioblastoma-specific antigens for the therapy. Cancer-germline genes are known to be related to the formation and progression of several cancer types by promoting tumor transformation. Dazl is one such germline gene and is up-regulated in a few germ cell cancers. In this study, we analyzed the expression of Dazl in human glioblastoma tissues and cells, and investigated its significance in proliferation, migration, invasion and chemoresistance of the glioblastoma cell lines.

方法:

膠芽腫組織の異なる病理学的グレードにおける Dazl の発現を免疫組織化学的に評価した。膠芽腫細胞および正常ヒトアストロサイト（NHA）細胞における Dazl の発現をウエスタンブロッティングおよび RT-qPCR により評価した。次に、CRISPR/Cas9遺伝子改変技術を用いてDazlノックアウトグリオブラストーマ細胞株を作製し、Dazlの細胞機能を調べた。その際には、CCK-8アッセイとアルカリホスファターゼ染色を用いて増殖形質と生殖細胞形質を検出した。膠芽腫細胞の遊走および浸潤を測定するために、ボイデンチャンバーアッセイを行った。クリスタルバイオレット染色を用いて、ドキソルビシンおよびテモゾロミドの処置後の生存細胞数を測定した。最後に、皮下異種移植試験を用いて、インビボでの腫瘍の増殖を測定した。

METHODS: We evaluated the expression of Dazl in different pathologic grades of glioblastoma tissues by immunohistochemistry. We assessed the expression of Dazl in glioblastoma cells and normal human astrocytes (NHA) cells by western blotting and RT-qPCR. Then we generated Dazl knockout glioblastoma cell lines using the CRISPR/Cas9 gene-editing technology to explore the cellular function of Dazl. We detected the proliferation and germline traits via CCK-8 assays and alkaline phosphatase staining, respectively. Boyden chamber assays were performed to measure glioblastoma cell migration and invasion. Crystal violet staining was used to determine the number of viable cells after the treatment of Doxorubicin and Temozolomide. Finally, we used subcutaneous xenograft studies to measure the growth of tumors in vivo.

結果:

膠芽腫組織および膠芽腫細胞株において Dazl がアップレギュレーションされていることを明らかにした。Dazlをノックダウンした膠芽腫細胞は、in vitroでは細胞増殖、遊走、浸潤、抵抗性の低下を示し、in vivoでは膠芽腫の発生を抑制した。膠芽腫細胞株A172、U251およびLN229は、幹細胞マーカーCD133、Oct4、NanogおよびSox2を発現していることが確認された。これらのマーカーの発現は、Dazl欠損細胞ではダウンレギュレーションされていた。

RESULTS: We found that Dazl was upregulated in glioblastoma tissues and glioblastoma cell lines. Dazl knockdown glioblastoma cells showed decreased cellular proliferation, migration, invasion, and resistance in vitro, and inhibited the initiation of glioblastoma in vivo. The glioblastoma cell lines A172, U251, and LN229 were found to express stem cell markers CD133, Oct4, Nanog, and Sox2. The expression of these markers was downregulated in Dazl-deficient cells.

結論:

これらの結果から、Dazlは細胞の幹細胞化を抑制することで膠芽腫の腫瘍化に寄与していることが示唆された。このことから、Dazlは神経膠芽腫の腫瘍化に寄与することが示唆された。

CONCLUSIONS: Our results indicated that Dazl contributes to the tumorigenicity of glioblastoma via reducing cell stemness. Therefore, cancer-germline genes might represent a new paradigm of glioblastoma-initiating cells in the treatment of malignant tumors.