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腸管平滑筋由来の GDNF の MMP-9 処理は、腸管ニューロンに対する神経栄養作用に必要である
MMP-9 processing of intestinal smooth muscle-derived GDNF is required for neurotrophic action on enteric neurons.
PMID: 32682824 DOI: 10.1016/j.neuroscience.2020.07.018.
抄録
ニューロトロフィーGDNFは、胚発生期における腸管神経系（ENS）の発達を誘導し、in vitroでは出生後の腸管ニューロンの生存と軸索伸長を誘導する。腸管平滑筋細胞におけるGDNFの発現は動的であり、in vitroでは炎症性サイトカインによるアップレギュレーション、in vivoでは腸管炎症によるアップレギュレーションが見られるが、翻訳後のタンパク質分解開裂の役割は不明である。腸管ニューロン、平滑筋、グリアの共培養モデルでは、セリンまたはシステインプロテアーゼ活性の阻害は、TNFαによって引き起こされる軸索密度の2倍以上の増加に対して効果がなかった。しかし、メタロプロテアーゼ（MMP）の阻害剤はMMP-9の重要な役割を明らかにし、qPCRとウエスタンブロットにより、炎症性サイトカインが細胞溶解物と条件付き培地（CM）の両方でMMP-9のmRNAとタンパク質の発現を増加させることが示されました。MMP-9を阻害することにより、成体ラット大腸からの腸管平滑筋細胞（ISMC）の共培養物や細胞株のCMや細胞溶解物において、サイトカイン誘発性の成熟GDNFの増加が抑制された。ウェスタンブロットでは、TNBS誘発大腸炎の2日目に分離されたISMCにおいて、成熟GDNFとMMP-9が対照と比較して平行に増加していることが示された。それにもかかわらず、GDNFプラスミドをキャリアシステムとしてHEK-293細胞にトランスフェクションした場合、あるいは共培養モデルに直接トランスフェクションした場合には、MMP-9に依存した強い神経栄養作用が認められた。これらの結果から、GDNFのインビトロでの神経栄養作用にはMMP-9の活性が必要であることが明らかになった。しかし、炎症性サイトカインによる腸管平滑筋におけるGDNFとMMP-9の協調的なアップレギュレーションは、ENSへの炎症性ダメージを制限する支持的な標的細胞由来の環境を提供する。
The neurotrophin GDNF guides development of the enteric nervous system (ENS) in embryogenesis and directs survival and axon outgrowth in postnatal myenteric neurons in vitro. GDNF expression in intestinal smooth muscle cells is dynamic, with upregulation by inflammatory cytokines in vitro or intestinal inflammation in vivo, but the role of post-translational proteolytic cleavage is undefined. In a co-culture model of myenteric neurons, smooth muscle and glia, inhibition of serine or cysteine protease activity was ineffective against the >2-fold increase in axon density caused by TNFα. However, inhibitors of metalloproteinases (MMP) identified an essential role of MMP-9, and qPCR and western blotting showed that pro-inflammatory cytokines increased both mRNA and protein expression for MMP-9, in both cellular lysates and conditioned medium (CM). Inhibition of MMP-9 prevented the cytokine-induced increase in mature GDNF in CM or cellular lysates of co-cultures or cell lines of intestinal smooth muscle cells (ISMC) from adult rat colon. Western blotting showed parallel upregulation of mature GDNF and MMP-9 vs control in ISMC isolated on Day 2 of TNBS-induced colitis. Nonetheless, transfection of GDNF plasmid into HEK-293 cells as a carrier system, or directly into the co-culture model, conveyed a strong neurotrophic effect that was MMP-9 dependent. We conclude that MMP-9 activity is required for the neurotrophic effects of GDNF on myenteric neurons in vitro. However, the coordinated upregulation of GDNF and MMP-9 in intestinal smooth muscle by inflammatory cytokines provides a supportive, target cell-derived environment that limits inflammatory damage to the ENS.
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