融合タンパク質法を用いたHelianthus annuus Linn由来シンナメート4-ヒドロキシラーゼの機能解析

Functional Characterization of Cinnamate 4-hydroxylase from Helianthus annuus Linn Using a Fusion Protein Method.

• Ziwen Wang
• Xiangyun Jian
• Yucheng Zhao
• Shan Li
• Ziwei Sui
• Li Li
• Lingyi Kong
• Jun Luo

抄録

ヒマワリ（Helianthus annuus L.）は重要な油糧作物であり、その二次代謝物にはフラボノイドやリグニンなど多くの化合物が含まれています。しかし、ヒマワリのフェノール化合物の生合成に関する研究はまだ乏しい。シナメート4-ヒドロキシラーゼ（C4H）はチトクロームP450依存性モノオキシゲナーゼファミリーに属し、多くのフェノール化合物の合成に関与しているが、ヒマワリのC4Hはまだクローン化されておらず、機能的にも特徴づけられていない。本研究では、ヒマワリのトランスクリプトームとゲノムデータベースから、それぞれHaC4H1、HaC4H2、HaC4H3と名付けられた3つのC4H遺伝子をスクリーニングした。異種発現実験では、これまでの研究から制限部位を追加することで、複数のC4H機能を発現させやすく、インビトロでの活性検証に適した方法を改良していたが、今回の実験では、制限部位を追加することで、複数のC4H機能を発現させやすくした。N末端の膜アンカー領域を持たないHaC4Hを、シロイヌナズナ・タリアナのシトクロムP450酵素（CYP450）のレドックスパートナーと本方法で融合させ、大腸菌で機能発現させたところ、これら3つの酵素がp-クマリン酸の生成を触媒することが示された。我々の融合タンパク質アプローチが他のC4Hにも適用できるかどうかをさらに調べるために、この方法を用いてPeucedanum praeruptorumおよびAngelica decursiva由来のC4Hの機能を調べたところ、これらのC4Hはトランス桂皮酸をp-クマリン酸に変換することもできることがわかった。遺伝子発現プロファイルを調べたところ、3つのHaC4H遺伝子はいずれも根で最も高い転写レベルを示し、MeJAによってアップレギュレーションされている可能性があることがわかった。まとめると、これらの結果は、ヒマワリにおけるHaC4Hの機能を明らかにし、原核生物の発現系におけるC4H、さらには他のチトクロームP450酵素を探索するためのより簡単な方法を提供する。

Sunflower (Helianthus annuus L.) is an important oil crop, the secondary metabolites of it include many compounds such as flavonoids and lignin. However, the research on the biosynthesis of phenolic compounds in sunflowers is still scarce. Cinnamate 4-hydroxylase (C4H) belongs to the cytochrome P450-dependent monooxygenase family and is involved in the synthesis of many phenolic compounds, but C4H in sunflowers has not yet been cloned and functionally characterized. In this study, we screened three C4H genes from the sunflower transcriptome and genomic databases, named HaC4H1, HaC4H2, and, HaC4H3, respectively. In heterologous expression experiments, we had improved a method from previous studies by the addition of restriction sites to make it easier to express multiple C4H functions and suitable for in vitro activity verification. HaC4Hs without the N-terminal membrane anchor region was fused with a redox partner of Arabidopsis thaliana cytochrome P450 enzyme (CYP450) by the method and functionally expressed in E. coli and the results showed that these three enzymes catalyzed the formation of p-coumaric acid. To further investigate whether our fusion protein approach is applicable to other C4Hs, we used this method to explore the functions of C4H from Peucedanum praeruptorum and Angelica decursiva, and they can also convert trans-cinnamic acid to p-coumaric acid. The gene expression profile showed that all three HaC4H genes showed the highest transcription levels in the roots and might be up-regulated by MeJA. In summary, these results reveal the function of HaC4Hs in sunflower and provide a simpler way to explore C4H and even other cytochrome P450 enzymes in prokaryotic expression systems.

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