高移動度群蛋白質B1によるCD11b細胞麻痺の抑制による重症敗血症の内皮に対する神風注射の保護効果

[Protective effect of Shenfu injection on the endothelium of severe sepsis by inhibiting CD11b cell paralysis induced by high mobility group protein B1].

• Yan Xing
• Dongliang Cheng
• Changsong Shi

抄録

目的:

乳児豚の重症敗血症の生化学的パラメータ、肺の病理学的損傷と免疫機構との関係、および神風注射の介入効果を検討する。

OBJECTIVE: To investigate the relationship between the biochemical parameters, the pulmonary pathologic injury and the immune mechanism of severe sepsis in infant porcine, and the intervention effect of Shenfu injection.

方法:

パナマ産の乳児ブタ（生後2～3ヶ月）を、シャム手術群（シャム群；通常の生理食塩水を静脈内注射）、リポポリサッカライド（LPS）誘発重症敗血症モデル群（LPS群；LPS 1mg/kgを静脈内注射、継続は0.5mg/kg）に分けて投与した。5 mg×kg×h、12時間）、神風注射介入群（SF群；モデル化と同時に神風注射10mL/kgを1日2回静脈内注射）を乱数表法により、各群5名とした。チャレンジ後４８時間後、採血によりＣ反応性蛋白（ＣＲＰ）、プロカルシトニン（ＰＣＴ）、酸素化指数（ＰａＯ／ＦｉＯ）、塩基過剰（ＢＥ）、血中乳酸（Ｌａｃ）等の生化学的指標の変化を検出した；末梢血中の好中球［ミエロペルオキシダーゼ陽性（ＭＰＯ）］およびその活性化サブセットＣＤ１１ｂＣＤ６４、Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８０ＣＤ６４）、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーにより分析した。血漿中のサイトカインのレベルは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）により検出した。肺組織の病理学的損傷は、ヘマトキシリン-エオシン（HE）染色により観察した。肺損傷関連分子とその受容体、ケモカイン、サイトカイン、血管内皮関連分子、タイトジャンクションタンパク質のmRNA発現を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）で検出した。

METHODS: Panamanian infant porcine (2-3 months old) were divided into sham operation group (Sham group; intravenous injection of normal saline), lipopolysaccharide (LPS) induced severe sepsis model group (LPS group; intravenous injection of LPS 1 mg/kg, and continuing at 0.5 mg×kg×h for 12 hours), and Shenfu injection intervention group (SF group; intravenous injection of Shenfu injection 10 mL/kg at the same time of modeling, twice a day) according to the random number table method, with 5 in each group. Forty-eight hours after the challenge, the changes of C-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT), oxygenation index (PaO/FiO), base excess (BE), blood lactate (Lac) and other biochemical indexes were detected with blood sampling; the number of neutrophils [myeloperoxidase positive (MPO)] and their activated subsets CD11bCD64, M1 macrophages (CD80CD64), CD4 and CD8 T cells were analyzed in peripheral blood by flow cytometry. The levels of plasma cytokines were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The pathological damage of lung tissue was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. The mRNA expression of lung injury related molecules and their receptors, chemokines, cytokines, vascular endothelial related molecules and tight junction protein were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

結果:

シャム群と比較して、LPS群ではCRP、PCT、Lacの値が有意に上昇し、PaO/FiO、BEの値が有意に低下した。末梢血では、CD80CD64マクロファージ、CD11bCD64、MPO好中球、CD4、CD8 T細胞、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）が有意に減少したが、インターロイキン-10（IL-10）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が有意に増加した。高移動度群蛋白質B1（HMGB1）、高度糖化末端産物受容体（RAGE）、アンジオポエチン2/アンジオポエチン1（Ang2/Ang1）のmRNA発現が有意に増加し、Toll様受容体9（TLR9）、ケモカイン（CXCL9およびCXCL10）、TNF-αの発現が有意に増加した。IL-27、Tek tyrosine kinase 2（TIE2）、血管内皮カドヘリン（VE-CAD）、オクルディンは肺組織で有意に減少した。HE染色では、肺胞腔内の炎症性細胞の浸潤・滲出、肺胞の圧密化、肺胞間質層の肥厚、肺気腫が認められた。SF群のLacはLPS群と比較して有意に減少し（mmol/L：4.2±1.0 vs. 6.3±1.1、P＜0.05）、BEおよびPaO/FiOは有意に増加した［BE（mmol/L）：-6.4±2.6 vs. -11.6±2.5、PaO/FiO（mmHg、1mmHg=0.133kPa）：180±36 vs. 105±35、いずれもP＜0.05］；CD80CD64マクロファージ、CD11bCD64及びMPO好中球の割合が有意に増加した［CD80CD64.(7.13±2.01)% vs. (3.80±0.46)%、CD11bCD64.(8.33±2.55)% vs (2.15±0.47)%, MPO.(21.22±2.33)% vs. (8.31±0.46)%、すべてP＜0.05］；HMGB1及びRAGEのmRNA発現はある程度低下した［HMGB1 mRNA(2)：1.81±0.45］。HMGB1 mRNA（2）：1.81±0.45 vs. 2.23±0.85、RAGE mRNA（2）：6.69±3.48 vs. 11.60±6.91、いずれもP＜0.05］、HMGB1およびRAGEのmRNA発現はある程度低下した［HMGB1 mRNA（2）：1.81±0.45 vs. 2.23±0.85、RAGE mRNA（2）：6.69±3.48 vs. 11.60±6.91、いずれもP＜0.05］、HMGB1およびRAGEのmRNA発現はある程度低下した［HMGB1 mRNA（2）：1.81±0.45 vs. 2.23±0.85、RAGE mRNA（2）：6.69±3.48 vs. 11.60±6.91］。05]、CXCL9とTIE2のmRNA発現がある程度増加した［CXCL9 mRNA（2）：1.06±0.63 vs. 0.50±0.12、TIE2 mRNA（2）：1.42±0.68 vs. 0.27±0.16、いずれもP＜0.05］；肺組織の病理学的損傷が有意に緩和された。

RESULTS: Compared with Sham group, the levels of CRP, PCT and Lac in LPS group significantly increased, and PaO/FiO and BE significantly decreased. In the peripheral blood, CD80CD64 macrophages, CD11bCD64 and MPO neutrophils, CD4, CD8 T cells and tumor necrosis factor-α (TNF-α) significantly decreased, but interleukin-10 (IL-10) and vascular endothelial cell growth factor (VEGF) significantly increased; the mRNA expressions of high mobility group protein B1 (HMGB1), receptor for advanced glycation end products (RAGE), angiopoietin 2/angiopoietin 1 (Ang2/Ang1) significantly increased, Toll like receptor 9 (TLR9), chemokines (CXCL9 and CXCL10), TNF-α, IL-27, Tek tyrosine kinase 2 (TIE2), vascular endothelial cadherin (VE-CAD) and Occludin significantly decreased in lung tissue. HE staining showed inflammatory cell infiltration and exudation in the alveolar cavity, alveoli consolidation, thickening of the alveolar interstitial layer and emphysema. Compared with LPS group, Lac in SF group significantly decreased (mmol/L: 4.2±1.0 vs. 6.3±1.1, P < 0.05), while BE and PaO/FiO significantly increased [BE (mmol/L): -6.4±2.6 vs. -11.6±2.5, PaO/FiO (mmHg, 1 mmHg = 0.133 kPa): 180±36 vs. 105±35, both P < 0.05]; the percentage of CD80CD64 macrophages, CD11bCD64 and MPO neutrophils significantly increased [CD80CD64: (7.13±2.01)% vs. (3.80±0.46)%, CD11bCD64: (8.33±2.55)% vs. (2.15±0.47)%, MPO: (21.22±2.33)% vs. (8.31±0.46)%, all P < 0.05]; the mRNA expressions of HMGB1 and RAGE decreased to some extent [HMGB1 mRNA (2): 1.81±0.45 vs. 2.23±0.85, RAGE mRNA (2): 6.69±3.48 vs. 11.60±6.91, both P < 0.05], the mRNA expressions of CXCL9 and TIE2 increased to a certain extent [CXCL9 mRNA (2): 1.06±0.63 vs. 0.50±0.12, TIE2 mRNA (2): 1.42±0.68 vs. 0.27±0.16, both P < 0.05]; the pathological damage of lung tissue were significantly alleviated.

結論:

BE、Lac、PaO/FiOの異常亢進、免疫の疲弊、麻痺が重症敗血症の乳児ブタの致命的な肺損傷につながる重要な因子である可能性がある。考えられるメカニズムとしては、HMGB1とその受容体RAGEの過剰な活性化、TLR9とそれに対応するケモカインや炎症因子の抑制が、内皮の損傷の増加とタイトコネクションの低下をもたらし、その結果、毛細血管の漏出を誘導することが考えられる。敗血症を伴う重症肺炎における神風注射による免疫障害の介入は、末梢血中のM1マクロファージおよび活性化好中球の上昇、HMGB1およびその受容体RAGE mRNA発現の抑制、CXCL9およびTIE2発現の上昇と関連している可能性がある。

CONCLUSIONS: The increased abnormality of BE, Lac, and PaO/FiO, the immune exhausting and paralysis may be important factors leading to the fatal lung injury in infant porcine with severe sepsis. The possible mechanism is that the excessive activation of HMGB1 and its receptor RAGE, the suppression of TLR9 and corresponding chemokine and inflammatory factors lead to increased endothelial damage and decreased tight connection, which in turn induces capillary leakage. The intervention of immune disorders by Shenfu injection in the severe pneumonia accompanied by sepsis may be related to elevated M1 macrophages and activated neutrophils in the peripheral blood, inhibition of HMGB1 and its receptor RAGE mRNA expression, and elevated CXCL9 and TIE2 expression.