細胞内有害先進糖化最終生成物（TAGE）がマウス筋芽細胞死に及ぼす影響

Impact of intracellular toxic advanced glycation end-products (TAGE) on murine myoblast cell death.

• Takanobu Takata
• Akiko Sakasai-Sakai
• Masayoshi Takeuchi

抄録

背景:

サルコペニアは、骨格筋量と機能の低下を特徴とする進行性の病態である。サルコペニアは生活習慣病（LSRD）と関連しているが、筋管に分化する筋芽細胞の細胞死のメカニズムは不明である。我々はこれまでに、グリセルアルデヒド（グルコース／フルクトース代謝の中間体）由来の高度糖化最終生成物（AGE）が細胞毒性を有し、LSRDに関与していることから、毒性AGE（Toxic AGE）と命名し、TAGEが筋芽細胞の細胞死に関与しているとの仮説を立ててきた。

Background: Sarcopenia is a progressive condition that is characterized by decreases in skeletal muscle mass and function. Although sarcopenia is associated with lifestyle-related diseases (LSRD), the mechanisms underlying cell death in myoblasts, which differentiate to myotubes, remain unclear. We previously designated glyceraldehyde (an intermediate of glucose/fructose metabolism)-derived advanced glycation end-products (AGEs) as toxic AGEs (TAGE) because of their cytotoxicity and involvement in LSRD, and hypothesized that TAGE contribute to cell death in myoblasts.

方法:

マウス筋芽細胞であるC2C12細胞を0, 0.5, 1, 1.5, 2mMグリセルアルデヒドで24時間処理した。細胞生存率および細胞内TAGEを、5-[2,4,-bis(sodioxysulfonyl)phenyl]-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2-tetrazole-3-ium(WST-8)およびスロットブロットアッセイを用いて評価した。細胞は、AGE産生の阻害剤である8mMアミノグアニジンで2時間前処理した後、0、1.5、および2mMグリセルアルデヒドで24時間前処理した。その後、細胞生存率および細胞内TAGEレベルを評価した。4つのステージ（無ステアトーシス、単純ステアトーシス、ステアト肝炎、および線維化）が存在するSTAMマウスにおける血清TAGEレベルを、競合酵素連結免疫吸着アッセイを用いて測定した。結果は、血清1mlあたりのTAGE単位（U）として表され、1 Uはグリセルアルデヒド由来AGE-ウシ血清アルブミン（BSA）（TAGE-BSA）の1.0μgに対応するものであった。20、50、および100μg/mLの非糖化BSAおよびTAGE-BSAで24時間処理した細胞の生存率をWST-8アッセイを用いて評価した。

Methods: C2C12 cells, which are murine myoblasts, were treated with 0, 0.5, 1, 1.5, and 2 mM glyceraldehyde for 24 h. Cell viability and intracellular TAGE were then assessed using 5-[2,4,-bis(sodioxysulfonyl)phenyl]-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2-tetrazole-3-ium (WST-8) and slot blot assays. Cells were pretreated with 8 mM aminoguanidine, an inhibitor of AGE production, for 2 h, followed by 0, 1.5, and 2 mM glyceraldehyde for 24 h. Cell viability and intracellular TAGE levels were then assessed. Serum TAGE levels in STAM mice, in which there were four stages (no steatosis, simple steatosis, steatohepatitis, and fibrosis), were measured using a competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Results were expressed as TAGE units (U) per milliliter of serum, with 1 U corresponding to 1.0 μg of glyceraldehyde-derived AGE-bovine serum albumin (BSA) (TAGE-BSA). The viability of cells treated with 20, 50, and 100 μg/mL non-glycated BSA and TAGE-BSA for 24 h was assessed using the WST-8 assay.

結果:

1.5および2mMグリセルアルデヒドで処理したC2C12細胞では、細胞生存率が47.7%(=0.0021)および5.0%(=0.0001)に低下し、細胞内TAGEレベルがそれぞれ6.0および15.9μg/mgタンパク質に上昇した。細胞生存率およびTAGE産生の変化は、8mMアミノグアニジンによって完全に阻害された。血清TAGE値は、それぞれ10.51±1.16及び10.44±0.95 U/mLであり、無ステアトーシス期（7.27±0.18 U/mL）よりも高値であった。20μg/mLのTAGE-BSAおよび50μg/mLのTAGE-BSAでは細胞死は誘導されなかった。100μg/mLの非糖化BSAとTAGE-BSAで処理したC2C12細胞の生存率は、それぞれ105.0%(=0.2890)と85.3%(=0.0217)であった。

Results: In C2C12 cells treated with 1.5 and 2 mM glyceraldehyde, cell viability decreased to 47.7% (= 0.0021) and 5.0% (= 0.0001) and intracellular TAGE levels increased to 6.0 and 15.9 μg/mg protein, respectively. Changes in cell viability and TAGE production were completely inhibited by 8 mM aminoguanidine. Serum TAGE levels at the steatohepatitis and fibrosis stages were 10.51 ± 1.16 and 10.44 ± 0.95 U/mL, respectively, and were higher than those at the no steatosis stage (7.27 ± 0.18 U/mL). Cell death was not induced by 20 or 50 μg/mL TAGE-BSA. The viabilities of C2C12 cells treated with 100 μg/mL non-glycated BSA and TAGE-BSA were 105.0% (= 0.2890) and 85.3% (= 0.0217), respectively.

結論:

細胞内TAGEはC2C12細胞の細胞死を強く誘導し、LSRDモデルマウスでは筋芽細胞の細胞死を誘導する可能性があることが示唆された。

Conclusion: Intracellular TAGE strongly induced cell death in C2C12 cells and may also induce myoblast cell death in LSRD model mice.

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