微小環境駆動型CD44アイソフォーム発現の可塑性がCRC細胞株における移植と幹様表現型を決定する

Microenvironmentally-driven Plasticity of CD44 isoform expression determines Engraftment and Stem-like Phenotype in CRC cell lines.

• Thiemo F Dinger
• Oleg Chen
• Claudia Dittfeld
• Lydia Hetze
• Melanie Hüther
• Marit Wondrak
• Steffen Löck
• Wolfgang Eicheler
• Georg Breier
• Leoni A Kunz-Schughart

抄録

大腸がん（CRC）におけるがん幹細胞（CSC）の治療法は、患者に応じた治療戦略を開発するためのトランスレーショナルリサーチの中でも特に注目されている。現在も議論が続いている表面タンパク質は、CD44とCD133である。これらの抗原の構造的・機能的多様性とその可塑性については、まだ解明され始めたばかりである。我々は、CD133/CD44の可塑性について新たな知見を得ることを目的としており、それにより、マーカーに関連した腫瘍性および非腫瘍性の表現型は、環境によって駆動されるという仮説を証明することができた。 20のCRC細胞株のCD133/CD44プロファイルをモニターし、異なる表面パターンを持つ3つのモデルを系統的に検討した。CD133/CD44サブ集団はFACSにより分離され、増殖時および/または限界希釈接ぎ木試験で分析された。実験セットアップには、タンパク質（フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光）とmRNAレベル（RT/qPCR）のバイオマーカー分析とCD44遺伝子のシークエンシングが含まれていた。 一般的に、(i)CD133/CD44パターンは決して接ぎ木移植を決定しないこと、(ii)CD133/CD44集団の分布は条件の下で調和していることがわかった。その結果、LS1034細胞株は、CD44が発現していることから、ユニークなモデルとして登場した。LS1034細胞のバイオマーカーパターンは二次移植を反映していた：腫瘍原性はCD133/CD44で最も高く、CD133/CD44では中間的で、CD133/CD44のサブフラクションでは完全に失われていた。CD44とCD44 LS1034の両方の細胞は、腫瘍性の子孫と非腫瘍性の子孫を生み出し、転換することができましたが、CD133を発現している限りは転換することができませんでした。腫瘍性の高いCD133/CD44(v8-10) LS1034細胞は、十分に酸素化された血管周囲に局在していたが、低酸素領域には局在していなかった。数多くの調節因子の中から、間質線維芽細胞との直接相互作用のみが、CD44v8-10の発現の本質的な増強を引き起こした。 環境条件は、CD133/CD44の表現型とCRC亜集団の腫瘍性の可能性を調節する。癌特異的CD44発現プロファイルと可塑性のドライバーとしての線維芽細胞の同定は、バイオマーカーとしてのそれ自体の動的な表面抗原の限界に光を当てています。また、CD133/CD44陽性のCRC CSCが、がん関連の線維芽細胞で構成されている可能性の高い血管周囲ニッチに存在することを説明することができる。LS1034モデルは、間質細胞によるCD44v8-10発現のメカニズムを解明し、微小環境と腫瘍性表現型の相互関係を明らかにするための貴重なツールである。

Theranostic biomarkers for putative cancer stem-like cells (CSC) in colorectal cancer (CRC) are of particular interest in translational research to develop patient-individualized treatment strategies. Surface proteins still under debate are CD44 and CD133. The structural and functional diversity of these antigens, as well as their plasticity, has only just begun to be understood. Our study aimed to gain novel insight into the plasticity of CD133/CD44, thereby proving the hypothesis of marker-associated tumorigenic and non-tumorigenic phenotypes to be environmentally driven. CD133/CD44 profiles of 20 CRC cell lines were monitored; three models with distinct surface patterns were systematically examined. CD133/CD44 subpopulations were isolated by FACS and analyzed upon growth and/or in limiting dilution engraftment studies. The experimental setup included biomarker analyses on the protein (flow cytometry, Western blotting, immunofluorescence) and mRNA levels (RT-/qPCR) as well as CD44 gene sequencing. In general, we found that (i) the CD133/CD44 pattern never determined engraftment and (ii) the CD133/CD44 population distributions harmonized under conditions. The LS1034 cell line appeared as a unique model due to its presentation of CD44. was identified as main transcript, which was stronger expressed in primary human CRC than in normal colon tissues. Biomarker pattern of LS1034 cells reflected secondary engraftment: the tumorigenic potential was highest in CD133/CD44, intermediate in CD133/CD44 and entirely lost in CD133/CD44 subfractions. Both CD44 and CD44 LS1034 cells gave rise to tumorigenic and non-tumorigenic progeny and were convertible - but only as long as they expressed CD133 . The highly tumorigenic CD133/CD44(v8-10) LS1034 cells were localized in well-oxygenated perivascular but not hypoxic regions. From a multitude of putative modulators, only the direct interaction with stromal fibroblasts triggered an essential, -like enhancement of CD44v8-10 presentation . Environmental conditions modulate CD133/CD44 phenotypes and tumorigenic potential of CRC subpopulations. The identification of fibroblasts as drivers of cancer-specific CD44 expression profile and plasticity sheds light on the limitation of per se dynamic surface antigens as biomarkers. It can also explain the location of putative CD133/CD44-positive CRC CSC in the perivascular niche, which is likely to comprise cancer-associated fibroblasts. The LS1034 model is a valuable tool to unravel the mechanism of stromal-induced CD44v8-10 expression and identify further therapeutically relevant, mutual interrelations between microenvironment and tumorigenic phenotype.

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