LncRNA DLX6-AS1 は、Mir-199b-5p/Paxillin 軸の調節を介して、三重陰性乳癌における上皮間葉転移とシスプラチン抵抗性に寄与している

LncRNA DLX6-AS1 Contributes to Epithelial-Mesenchymal Transition and Cisplatin Resistance in Triple-negative Breast Cancer via Modulating Mir-199b-5p/Paxillin Axis.

• Chuang Du
• Yan Wang
• Yingying Zhang
• Jianhua Zhang
• Linfeng Zhang
• Jingruo Li

抄録

三陰性乳癌（TNBC）は、再発、転移、薬剤耐性を有する最も侵攻性の高い癌の一つである。最近の研究では、長いノンコーディングRNA（lncRNA）を介した競合性内因性RNA（ceRNA）がTNBCの腫瘍形成や薬剤耐性に重要な役割を果たしていることが報告されている。lncRNA DLX6アンチセンスRNA 1（DLX6-AS1）の上昇は、様々な癌において発癌を促進することが観察されているが、TNBCにおける役割は明らかにされていなかった。本研究では、TNBC 組織および細胞株において、DLX6-AS1 の発現量を定量的リアルタイム PCR (RT-qPCR) で測定したところ、正常組織および乳房線維芽細胞と比較して、DLX6-AS1 の発現量が増加していた。次に、DLX6-AS1のsiRNAをトランスフェクションしたCAL-51細胞またはDLX6-AS1オーバー発現プラスミドをトランスフェクションしたMDA-MB-231細胞を用いて、CCK-8アッセイ、細胞コロニー形成アッセイおよびウエスタンブロットを行った。DLX6-AS1をノックダウンすると細胞増殖、上皮間葉転換（EMT）、BCL2アポトーシスレギュレーター（Bcl-2）、スネイルファミリー転写抑制因子1（Snail）、N-カドヘリンの発現レベルが低下し、切断されたカスパーゼ-3、γ-カテニン、E-カドヘリンの発現レベルが低下したが、DLX6-AS1のアップレギュレーションはその逆の効果を示した。また、CAL-51細胞でのDLX6-AS1のノックダウンやMDA-MB-231細胞でのDLX6-AS1のアップレギュレーションは、シスプラチン抵抗性を低下させたり、増加させたりすることが明らかになった。さらに、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ、RNA免疫沈降法、RNAプルダウンアッセイを用いて、lncRNA DLX6-AS1、microRNA-199b-5p（miR-199b-5p）、パキシリン（PXN）からなるceRNAを同定した。また、DLX6-AS1は、TNBC細胞においてmiR-199b-5p/PXNを介して機能していた。最後に、ヌードマウスを用いた異種移植実験の結果、DLX6-AS1はin vivoでmiR-199b-5p/PXN軸を介して細胞増殖、EMT、シスプラチン抵抗性を制御していることが明らかになった。要するに、DLX6-AS1はin vitroおよびin vivoのTNBCにおいて、miR-199b-5p/PKNシグナルを介して細胞増殖、EMTおよびシスプラチン抵抗性を促進した。

Triple-negative breast cancer (TNBC) is one of the most aggressive cancer types with high recurrence, metastasis, and drug resistance. Recent studies report that long noncoding RNAs (lncRNAs)-mediated competing endogenous RNAs (ceRNA) play an important role in tumorigenesis and drug resistance of TNBC. Although elevated lncRNA DLX6 antisense RNA 1 (DLX6-AS1) has been observed to promote carcinogenesis in various cancers, the role in TNBC remained unclear. In this study, expression levels of DLX6-AS1 were increased in TNBC tissues and cell lines when compared with normal tissues or breast fibroblast cells which were determined by quantitative real-time PCR (RT-qPCR). Then, CCK-8 assay, cell colony formation assay and western blot were performed in CAL-51 cells transfected with siRNAs of DLX6-AS1 or MDA-MB-231 cells transfected with DLX6-AS1 over expression plasmids. Knock down of DLX6-AS1 inhibited cell proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), decreased expression levels of BCL2 apoptosis regulator (Bcl-2), Snail family transcriptional repressor 1 (Snail) as well as N-cadherin and decreased expression levels of cleaved caspase-3, γ-catenin as well as E-cadherin, while up regulation of DLX6-AS1 had the opposite effect. Besides, knockdown of DLX6-AS1 in CAL-51 cells or up regulation of DLX6-AS1 in MDA-MB-231 cells also decreased or increased cisplatin resistance of those cells analyzed by MTT assay. Moreover, by using dual luciferase reporter assay, RNA immunoprecipitation and RNA pull down assay, a ceRNA which was consisted by lncRNA DLX6-AS1, microRNA-199b-5p (miR-199b-5p) and paxillin (PXN) was identified. And DLX6-AS1 function through miR-199b-5p/PXN in TNBC cells. Finally, results of xenograft experiments using nude mice showed that DLX6-AS1 regulated cell proliferation, EMT and cisplatin resistance by miR-199b-5p/PXN axis in vivo. In brief, DLX6-AS1 promoted cell proliferation, EMT, and cisplatin resistance through miR-199b-5p/PXN signaling in TNBC in vitro and in vivo.