キメラDNA-RNAガイドを用いたCRISPR-Cas12aの標的特異性の向上

Enhancement of target specificity of CRISPR-Cas12a by using a chimeric DNA-RNA guide.

• Hanseop Kim
• Wi-Jae Lee
• Yeounsun Oh
• Seung-Hun Kang
• Junho K Hur
• Hyomin Lee
• WooJeung Song
• Kyung-Seob Lim
• Young-Ho Park
• Bong-Seok Song
• Yeung Bae Jin
• Bong-Hyun Jun
• Cheulhee Jung
• Dong-Seok Lee
• Sun-Uk Kim
• Seung Hwan Lee

抄録

CRISPR-Cas9システムは、標的特異的ゲノム工学に広く利用されています。CRISPR-Cas12a（Cpf1）は、チミンリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を認識することで標的遺伝子を制御するCRISPRエフェクターの一つである。Cas12aは、Cas9よりもガイドRNAのミスマッチに対する感度が高く、そのため、オフターゲット配列の認識や切断が低い。しかし、プロトスペーサーのPAM配列から遠い領域（TTTNまたはTTN）のミスマッチを許容しており、治療目的でCas12aの活性を高めた場合には、オフターゲット開裂の問題がより問題になる可能性がある。そこで、Cas12aによるオフターゲット開裂を調べ、Cas12a (cr)RNAを改変してオフターゲット開裂の問題に対処した。(cr)RNAをDNAで部分的に置換し、標的DNAとの塩基対のエネルギーポテンシャルを変化させることで、標的DNA配列の変異を高特異的かつ効果的に誘導できるCRISPR-Cas12aを開発しました。キメラ(cr)RNAガイド型CRISPR-Cas12aとSpCas9ニカーゼが細胞内ゲノムでどのように効果的に働くかを説明するモデルが提案されている。キメラガイドベースのCRISPR-Cas12aゲノム編集は、標的外切断を低減し、その結果、安全性が向上することから、遺伝子変異に起因する難病の治療への応用が期待されている。

The CRISPR-Cas9 system is widely used for target-specific genome engineering. CRISPR-Cas12a (Cpf1) is one of the CRISPR effectors that controls target genes by recognizing thymine-rich protospacer adjacent motif (PAM) sequences. Cas12a has a higher sensitivity to mismatches in the guide RNA than does Cas9; therefore, off-target sequence recognition and cleavage are lower. However, it tolerates mismatches in regions distant from the PAM sequence (TTTN or TTN) in the protospacer, and off-target cleavage issues may become more problematic when Cas12a activity is improved for therapeutic purposes. Therefore, we investigated off-target cleavage by Cas12a and modified the Cas12a (cr)RNA to address the off-target cleavage issue. We developed a CRISPR-Cas12a that can induce mutations in target DNA sequences in a highly specific and effective manner by partially substituting the (cr)RNA with DNA to change the energy potential of base pairing to the target DNA. A model to explain how chimeric (cr)RNA guided CRISPR-Cas12a and SpCas9 nickase effectively work in the intracellular genome is suggested. Chimeric guide-based CRISPR- Cas12a genome editing with reduced off-target cleavage, and the resultant, increased safety has potential for therapeutic applications in incurable diseases caused by genetic mutations.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.