Lactobacillus reuteri PNW1 のゲノムベースのプロバイオティクス関連性と安全性の統合的評価

Integrated genome-based probiotic relevance and safety evaluation of Lactobacillus reuteri PNW1.

• Kazeem Adekunle Alayande
• Olayinka Ayobami Aiyegoro
• Thizwilondi Michael Nengwekhulu
• Lebogang Katata-Seru
• Collins Njie Ateba

抄録

本研究では、Lactobacillus reuteri PNW1の全ゲノム配列を評価し、その安全性遺伝子を同定した。さらに、この菌株が産生するバクテリオシンを抽出し、病原性STECである大腸菌O177に対する有効性を試験した。ゲノムDNAは illuminal Miseq 装置で配列決定され、配列決定されたデータはSPAdesでアセンブルされる前に品質リードのために評価されました。このアセンブリのドラフトは、Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP)とRapid Annotations using Subsystems Technology (RAST)を用いてアノテーションを行った。さらなる下流の解析は、適切なバイオインフォマティクスツールを用いて実施した。生原性アミンの産生はHPLC分析により生化学的に確認した。ゲノムの長さは 2,430,215 bp、420 コンティグ、G+C 含有率 39%であった。有毒な生化学物質の生産に関与するとされる既知の遺伝子の中で、アルギニンデイミナーゼ（EC3.5.3.6）のみが発見された。D-乳酸脱水素酵素（EC1.1.1.1.28）、L-乳酸脱水素酵素（EC1.1.1.27）、バクテリオシン・ヘルベチシンJのコード化配列（CDS）が、他のプロバイオティクス上重要な遺伝子とともにゲノム内で発見されました。この菌株はリンコスアミド（lnuC）とテトラサイクリン耐性遺伝子（tetW）の耐性遺伝子のみを有していた。病原性因子のヒットは見られず，ヒトの病原体である可能性はゼロであった．L. reuteri PNW1のゲノム内には2つの無傷のプロファージ領域が検出され，OASISにより9つの挿入配列のCDSが同定された．また、Cas遺伝子に関連する5つのCDSがCRISPRのために同定された。バクテリオシン産生菌であるL. reuteri PNW1の部分精製後の最大阻害領域は、20.0±1.00 mm（粗）と23.3±1.15 mm（0.25 mg/ml時）であった。非ヒト病原体として予測される株で、他の多くの同定された望ましい特徴と相まって、L. reuteri PNW1は、プロバイオティクスのための良いと安全な候補を作るチャンスを持っているが、さらなるインビボでの調査がまだ必要である。

This study evaluates whole-genome sequence of Lactobacillus reuteri PNW1 and identifies its safety genes that may qualify it as a putative probiotic. It further extracted the bacteriocin produced by the strain and tested its effectiveness against pathogenic STEC E. coli O177. The genomic DNA was sequenced on illuminal Miseq instrument and the sequenced data was assessed for quality reads before assembled with SPAdes. The draft assembly was annotated with Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) and Rapid Annotations using Subsystems Technology (RAST). Further downstream analyses were carried out using appropriate bioinformatic tools. Production of biogenic amines was biochemically confirmed through HPLC analysis. The assembled genome was 2,430,215 bp long in 420 contigs with 39% G+C content. Among all known genes, putatively responsible for the production of toxic biochemicals, only arginine deiminase (EC3.5.3.6) was spotted. Coding sequences (CDS) putative for D-lactate dehydrogenase (EC1.1.1.28), L-lactate dehydrogenase (EC1.1.1.27) and bacteriocin helveticin J were found within the genome together with plethora of other probiotic important genes. The strain harbours only resistant genes putative for Lincosamide (lnuC) and Tetracycline resistant genes (tetW). There was no hit found for virulence factors and probability of the strain being a human pathogen was zero. Two intact prophage regions were detected within the genome of L. reuteri PNW1 and nine CDS were identified for insertion sequence by OASIS which are belong to seven different families. Five putative CDS were identified for the CRISPR, each associated with Cas genes. Maximum zone of inhibition exhibited by the bacteriocin produced L. reuteri PNW1 is 20.0±1.00 mm (crude) and 23.3±1.15 mm (at 0.25 mg/ml) after being partially purified. With the strain predicted as non-human pathogen, coupled with many other identified desired features, L. reuteri PNW1 stands a chance of making good and safe candidates for probiotic, though further in-vivo investigations are still necessary.