ゼブラフィッシュにおけるTMEM216欠損はコーンオプシンとロドプシンの誤局在化と光受容体変性を引き起こす

TMEM216 Deletion Causes Mislocalization of Cone Opsin and Rhodopsin and Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.

• Yu Liu
• Shuqin Cao
• Miao Yu
• Huaiyu Hu

抄録

目的:

毛様体移行帯テトラスパン膜貫通タンパク質であるTMEM216の変異は、ジュベール症候群とメッケル症候群に関連している。光受容体変性は、ジュベール症候群の顕著な表現型である。TMEM216がどのようにして光受容体の健康に寄与しているのかは十分に理解されていない。

Purpose: Mutations in TMEM216, a ciliary transition zone tetraspan transmembrane protein, are linked to Joubert syndrome and Meckel syndrome. Photoreceptor degeneration is a prominent phenotype in Joubert syndrome. How TMEM216 contributes to photoreceptor health is poorly understood.

方法:

CRISPRゲノム編集によりTMEM216ノックアウトゼブラフィッシュを作製した。TMEM216 欠失が光受容体に与える影響を免疫蛍光染色および電子顕微鏡で評価した。

Methods: We have generated tmem216 knockout zebrafish by CRISPR genome editing. The impact of TMEM216 deletion on photoreceptors was evaluated by immunofluorescence staining and electron microscopy.

結果:

ホモ接合体であるtmem216ノックアウトゼブラフィッシュは受精後21日以内に死亡した。その網膜は、ロッド光受容体外側セグメントマーカー4D2とコーン光受容体外側セグメントマーカーGタンパク質サブユニットαトランスデュクション2（GNAT2）に対する免疫反応性が低下していた。末端デオキシヌクレオチド転移酵素dUTPニックエンド標識（TUNEL）により、ノックアウト網膜でTUNEL陽性核の増加が認められ、光受容体の変性が示唆された。tmem216変異は、アセチル化α-チューブリン免疫染色で明らかになったように、光受容体の毛様体軸索の短縮をもたらした。ノックアウトしたゼブラフィッシュの光受容体は、ロドプシン、GNAT2、レッドオプシンなどの外側セグメントのタンパク質が内側セグメントと細胞体に誤って局在化していることを示した。また、電子顕微鏡で観察したところ、変異体光受容体は、外側セグメントの中で円板の短縮や小胞・液胞などの異常な円板形態を持つ外側セグメントを発達させていることが明らかになった。

Results: Homozygous tmem216 knockout zebrafish died before 21 days after fertilization. Their retina exhibited reduced immunoreactivity to rod photoreceptor outer segment marker 4D2 and cone photoreceptor outer segment marker G protein subunit α transducin 2 (GNAT2). Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) revealed an increase in TUNEL-positive nuclei in the knockout retina, indicating photoreceptor degeneration. The tmem216 mutation resulted in shortened photoreceptor ciliary axoneme, as revealed by acetylated α-tubulin immunostaining. Photoreceptors in knockout zebrafish exhibited mislocalization of outer segment proteins such as rhodopsin, GNAT2, and red opsin to the inner segment and cell bodies. Additionally, electron microscopy revealed that the mutant photoreceptors elaborated outer segment with abnormal disc morphology such as shortened discs and vesicles/vacuoles within the outer segment.

結論:

これらの結果から、TMEM216はゼブラフィッシュにおける外側セグメントの正常な円板構造の形成、外側セグメント物質の輸送、光受容体の生存に必須であることが示唆された。これらのTMEM216ノックアウトゼブラフィッシュは、光受容体外側セグメントの形成と維持をどのように制御しているかを研究する上で有用である。

Conclusion: Our results indicate that TMEM216 is essential for normal genesis of outer segment disc structures, transport of outer segment materials, and survival of photoreceptors in zebrafish. These tmem216 knockout zebrafish will be useful in studying how transition zone proteins regulate photoreceptor outer segment formation and maintenance.