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Pseudomonas fluorescens由来のキヌレニン3-モノオキシゲナーゼの酸化的半減反応における水素の動きから、水酸化のメカニズムが明らかになった
Hydrogen movements in the oxidative half-reaction of kynurenine 3-monooxygenase from Pseudomonas fluorescens reveal the mechanism of hydroxylation.
PMID: 32687799 DOI: 10.1016/j.abb.2020.108474.
抄録
キヌレニン3-モノオキシゲナーゼ（KMO）は、トリプトファンの異化経路において、l-キヌレニン（L-Kyn）から3-ヒドロキシキヌレニン（3-OHKyn）への変換を触媒する。P. fluorescens (PfKMO)由来のKMOの酸化的半減反応に及ぼすpHと重水素置換の影響を調べた。酸化的半反応で観察される3つの相は、ヒドロペルオキシフラビンの生成,ヒドロキシル化,生成物の放出である。これらの相の速度定数を測定したところ、pHの変化はほとんどなく、KMOの活性部位が触媒反応中に溶媒との交換から絶縁されていることが示唆された。溶媒のインベントリ調査から、水酸化相では2-3の溶媒同位体効果が観察され、この段階では2個以上のプロトンが飛行していることが示された。環状ペルデウテロ-L-Kynを基質とするヒドロキシル化段階の速度定数に対する逆同位体効果は0.84±0.01であり、非芳香族中間体の形成につながる遷移状態でのspからspへのハイブリダイゼーションへのシフトを示している。基質アナログであるメタ-ニトロベンゾイルアラニンのために収集された過渡状態データのpH依存性は、ヒドロペルオキシフラビンの近位にある基がpH5〜8.5の範囲で滴定され、8.8のpKaで記述することができることを示しています。より高いpH値がヒドロキシル化の速度を遅くしないことは、測定されたpKaがヒドロペルオキシフラビンのプロトンに関係していることを除外します。これらの観察結果は、C4a-ヒドロペルオキシフラビンのpKaが8.5であること、非芳香族種がヒドロキシル化の即時生成物であること、および基質の芳香環への酸素挿入中に少なくとも2つの溶媒由来のプロトンが飛行中であることを示しています。これらの観察のための統一的な機構論的提案が提案されている。
Kynurenine 3-monoxygenase (KMO) catalyzes the conversion of l-kynurenine (L-Kyn) to 3-hydroxykynurenine (3-OHKyn) in the pathway for tryptophan catabolism. We have investigated the effects of pH and deuterium substitution on the oxidative half-reaction of KMO from P. fluorescens (PfKMO). The three phases observed during the oxidative half reaction are formation of the hydroperoxyflavin, hydroxylation and product release. The measured rate constants for these phases proved largely unchanging with pH, suggesting that the KMO active site is insulated from exchange with solvent during catalysis. A solvent inventory study indicated that a solvent isotope effect of 2-3 is observed for the hydroxylation phase and that two or more protons are in flight during this step. An inverse isotope effect of 0.84 ± 0.01 on the rate constant for the hydroxylation step with ring perdeutero-L-Kyn as a substrate indicates a shift from sp to sp hybridization in the transition state leading to the formation of a non-aromatic intermediate. The pH dependence of transient state data collected for the substrate analog meta-nitrobenzoylalanine indicate that groups proximal to the hydroperoxyflavin are titrated in the range pH 5-8.5 and can be described by a pKa of 8.8. That the higher pH values do not slow the rate of hydroxylation precludes that the pKa measured pertains to the proton of the hydroperoxflavin. Together, these observations indicate that the C4a-hydroperoxyflavin has a pKa ≫ 8.5, that a non-aromatic species is the immediate product of hydroxylation and that at least two solvent derived protons are in-flight during oxygen insertion to the substrate aromatic ring. A unifying mechanistic proposal for these observations is proposed.
Copyright © 2020. Published by Elsevier Inc.