アルギン酸/キトサン修飾免疫調整チタンインプラントによるin vitroおよびin vivoでの骨形成の促進

Alginate/chitosan modified immunomodulatory titanium implants for promoting osteogenesis in vitro and in vivo.

• Xianzhen Yin
• Congling Yang
• Ziquan Wang
• Yan Zhang
• Yiting Li
• Jie Weng
• Bo Feng

抄録

バイオマテリアルによる骨形成にはマクロファージが不可欠であることが認識されてきた。しかし、骨形成の制御におけるマクロファージと材料の特性の具体的な役割や分子メカニズムについては、まだ明らかになっていない。免疫系と骨格系のクロストークを探求する学際的な分野である骨免疫学は、骨代替材料の視点を、免疫抑制材料から免疫調節材料へとシフトさせている。免疫調節機能を有するチタンインプラントを作製するために，アルギン酸／キトサン多層膜をチタニアナノチューブ（TNT）の表面に作製し，抗炎症性サイトカインであるインターロイキン（IL）-4の放出を制御することを試みた。免疫調整作用のあるチタン製インプラントの骨形成効果とその制御メカニズムを、BMSCsの異なる培養方法を用いてin vitroで調べた。アルギン酸/キトサン多層膜被覆試料（IL-4負荷の有無にかかわらず）は，バイオミネラリゼーションを促進し，BMSCsの骨形成遺伝子発現（BMP1α，ALP，OPN，OCN）をアップレギュレートすることにより，TNTよりも優れた直接的な骨形成能力を示した。特に、物質によって誘導されたマクロファージの極性（M1とM2）は、異なる経路を介してBMSCsの初期および中期の骨形成を促進した。M1はBMP6/SMADsとWnt10b/β-カテニンの両方の経路を活性化し、M2はTGF-β/SMADs経路を活性化した。材料の表面特性が後期骨形成を制御する上で支配的であったが、これは表面の化学組成（アルギン酸、キトサン、Caなど）に起因すると考えられる。また、IL-4を添加した試料は、材料由来の炎症性微小環境と材料表面特性の相乗効果により、3つのシグナル伝達経路を協調的に活性化し、優れた骨形成能を示した。ラット骨欠損モデルを用いたin vivo試験では、IL-4を担持した免疫調整インプラントがマクロファージの表現型を炎症性M1から抗炎症性M2へと移行させ、その後の新生骨形成を改善することに成功した。

The essentiality of macrophages for biomaterial-mediated osteogenesis has been increasingly recognized. However, it is still unclear what is the specific role and molecular mechanisms of macrophages and material properties in the regulation of osteogenesis. As an interdisciplinary field exploring the cross-talk between immune and skeletal systems, osteoimmunology has shifted the perspective of bone substitute materials from immunosuppressive materials to immunomodulatory materials. To fabricate an immunomodulatory Ti implant, alginate/chitosan multilayer films were fabricated on the surface of titania nanotubes (TNTs) to control the release of an anti-inflammatory cytokine interleukin (IL)-4 according to our previous work. The osteogenic effects and regulation mechanisms of the immunomodulatory Ti implants were investigated in vitro in different BMSCs culture modes. Alginate/chitosan multilayer-coated samples (with or without IL-4 loading) showed better direct osteogenic ability than TNTs by promoting biomineralization and up-regulating osteogenic gene expression (BMP1α, ALP, OPN, OCN) of BMSCs. Notably, material-induced macrophage polarization, M1 and M2, enhanced early and mid-stage osteogenesis of BMSCs via distinct pathways: M1 activated both BMP6/SMADs and Wnt10b/β-catenin pathways; while M2 activated TGF-β/SMADs pathway. Material surface properties dominated in regulating late osteogenesis probably due to the surface chemical composition (alginate, chitosan and Ca, etc.). Due to synergistic effects of material-induced inflammatory microenvironment and material surface properties, IL-4-loaded samples exhibited superior osteogenic capability through co-activation of three signaling pathways. The in vivo studies in rat bone defect model revealed that IL-4-loaded immunomodulatory implants successfully achieved macrophage phenotypic transition from pro-inflammatory M1 to anti-inflammatory M2 and subsequently improved new bone formation.

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