喘息患者の唾液に含まれる細胞外小胞の分離と特性評価

Isolation and characterization of extracellular vesicles in saliva of children with asthma.

抄録

目的:

小児喘息患者の無細胞唾液（CFS）中に細胞外小胞（EV）が存在することを確認し、分離されたEVの集団を説明する。

Aim: To confirm the presence of extracellular vesicles (EVs) in cell-free saliva (CFS) of children with asthma and describe the isolated EV population.

方法:

ExoQuick-TCを用いて180人の参加者から分離したCFS EVのプールサンプルを下流の分析で調べた。透過型電子顕微鏡（TEM）を用いてEVの存在を確認した。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてEVの存在を確認し、ナノ粒子追跡分析(NTA)と蛍光を用いた単一粒子干渉反射イメージングセンシング(SP-IRIS)を用いてEVのサイズ、計数、表現型を確認した。タンパク質の定量にはキャピラリーイムノアッセイを用いた。

Methods: A pooled sample of CFS EVs isolated from 180 participants using ExoQuick-TC was examined in downstream analyses. Transmission electron microscopy (TEM) was used to confirm the presence of EVs. Nanoparticle tracking analysis (NTA) and single particle interferometric reflectance imaging sensing (SP-IRIS) with fluorescence were used for sizing, counting, and phenotyping of EVs. Capillary immunoassays were used for protein quantitation.

結果:

TEM観察の結果、様々なサイズのEVが存在することが確認され、プレパラートにはEVの異種集団が含まれていることがわかった。キャピラリーイムノアッセイでは、EVに関連するタンパク質（CD9, CD63, CD81, ICAM-1, ANXA5）の存在が確認され、細胞の混入は限定的であることが示された。しかし、他の研究者も報告しているように、EVの大きさや数の数え方にはプラットフォーム間で相違があった。蛍光NTAではモード径が約90nmの粒子が検出されたが、SP-IRISではTEMの結果に近い約55～60nmの粒子が検出された。タンパク質イムノアッセイの結果と同様に、蛍光を用いたSP-IRISでは、これらのEVの大部分がCD9およびCD63陽性であり、CD81の発現はほとんど見られなかった。

Results: TEM confirmed the presence of EVs of diverse sizes, indicating the prep contained a heterogeneous population of EVs. Capillary immunoassays confirmed the presence of EV-associated proteins (CD9, CD63, CD81, ICAM-1, and ANXA5) and indicated limited cellular contamination. As others have also reported, there were discrepancies in the EV sizing and enumeration across platforms. Fluorescent NTA detected particles with a mode diameter of ~90 nm, whereas SP-IRIS reported sizes of ~55-60 nm that more closely approximated the TEM results. Consistent with protein immunoassay results, SP-IRIS with fluorescence showed that the majority of these EVs were CD9- and CD63-positive, with little expression of CD81.

結論:

CFSからのEVは、大規模な疫学研究にも対応可能なハイスループットな方法を用いて分離することができる。我々の知る限り、喘息患者のCFSのEVの特徴を明らかにしたのは我々が初めてである。喘息のバイオマーカーとしてCFSのEVを使用することは、さらなる調査が必要であり、今後の研究のための新たな道を開くものである。

Conclusion: EVs from CFS can be isolated using a high-throughput method that can be scaled to large epidemiological studies. To our knowledge, we are the first to characterize CFS EVs from patients with asthma. The use of CFS EVs as potential novel biomarkers in asthma warrants further investigation and opens a new avenue of research for future studies.