ヒト歯根膜由来細胞において、カルシトリオールとエナメルマトリックス誘導体は、セメント誘導とミネラル化を異なる様式で制御している

Calcitriol and enamel matrix derivative differentially regulated cemento-induction and mineralization in human periodontal ligament-derived cells.

抄録

背景:

歯槽骨とセメント質は、多くの生物学的および発生学的な類似性を有している。カルシトリオールの鉱化作用は以前から報告されている。しかし、そのセメント誘導作用は確認されていない。本研究では、ヒト歯根膜由来細胞（hPDLCs）に対するカルシトリオールおよびエナメルマトリックス誘導体（EMD）のセメント誘導作用の可能性を検討した。

BACKGROUND: Alveolar bone and cementum share many biological and developmental similarities. The mineralizing effect of calcitriol has been previously reported. Yet, its cemento-inductivity has not been confirmed. This study evaluated the potential cemento-inductivity effect of calcitriol and enamel matrix derivative (EMD) on human periodontal ligament-derived cells (hPDLCs).

方法:

抜歯した第三大臼歯または小臼歯から採取したhPDLCをカルシトリオール、またはEMDとともに培養した。セメント生成遺伝子の発現をリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて検討した．発現解析には，セメント芽細胞特異的マーカーであるセメント質タンパク質1（CEMP1），セメント質付着タンパク質（CAP），最近報告されたセメント芽細胞強化遺伝子であるsecreted frizzled related protein 1（SFRP1），Dickkopf-related protein 1（DKK1）も含まれた．アルカリホスファターゼ（ALP）活性、Alizarin Red、Von Kossa染色、走査型電子顕微鏡によるイメージングと元素マッピングにより、再石灰化能を評価した。

METHODS: The hPDLCs obtained from extracted third molars or premolars were cultured with calcitriol, or EMD. Cementogenic gene expression was examined using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Expression analysis also included cementoblast-specific markers, cementum protein 1 (CEMP1), cementum attachment protein (CAP), and recently reported cementoblast-enriched genes, secreted frizzled related protein 1 (SFRP1), and Dickkopf-related protein 1 (DKK1). Mineralization capacities were evaluated by alkaline phosphatase (ALP) activity, Alizarin Red, and Von Kossa staining followed by scanning electron microscope imaging and element mapping.

結果:

試験条件の中で、10nMのカルシトリオールは、ほとんどのセメント生成遺伝子、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、骨形成タンパク質の発現を増強した。1、骨形成タンパク質（BMP-2およびBMP-4）、コア結合因子サブユニットα-1/Runt関連転写因子2、I型コラーゲン、ALP、骨シアロタンパク質、オステオポンチン）、オステオカルシン、CEMP1、CAP、Wntシグナル負のモジュレーターであるSFRP1およびDKK1、そしてALP活性と鉱化形成が最も多く増強された。しかし、CEMP1タンパク質は中程度しか観察されなかった。一方、EMDはCEMP1とCAPを強く刺激したが、石灰化能力は弱かった。これは、石灰化を強く刺激すると石灰化特異的な因子が優勢になり、逆に弱くなると考えられる。

RESULTS: Among tested conditions, 10 nM calcitriol enhanced most cementogenic gene expression, transforming growth factor-β1, bone morphogenetic proteins (BMP-2 and BMP-4), core-binding factor subunit alpha-1/Runt-related transcription factor 2, Type I collagen, ALP, bone sialoprotein, osteopontin), osteocalcin, CEMP1, and CAP, and Wnt signaling negative modulators, SFRP1 and DKK1, along with highest ALP activity and mineralization formation in hPDLCs. However, only moderate CEMP1 protein was observed. In contrast, EMD stimulated stronger CEMP1 and CAP protein, but presented weaker mineralization capacity, hinting at the possibility that strong stimulation of mineralization might dominate cemetogenic specific factors and vice versa.

結論:

カルシトリオールは、骨誘導性が高いだけでなく、hPDLCの分化を開始し、石灰化を促進することにより、セメント生成遺伝子の発現を誘導する可能性が示された。EMDはカルシトリオールと比較して、CEMP1およびCAPタンパク質を高発現させ、より遅い時点でhPDLCのセメント誘導性を促進したが、ミネラル化はあまり促進されなかった。このように、カルシトリオールとEMDは、セメント誘導とミネラル化の促進に差異があり、様々な分化段階において作用していると考えられる。

CONCLUSIONS: Calcitriol demonstrated not only great osteoinductivity, but also the potential to induce cementogenic gene expression by initiating hPDLC differentiation and promoting mineralization. Compared with calcitriol, EMD promoted cemento-inductivity in hPDLCs at a later time point via highly expressed CEMP1 and CAP protein, but with less mineralization. Thus, calcitriol and EMD could provide differential enhancement of cemento-induction and mineralization, likely acting at various differentiation stages.