慢性腎臓病においてNRF2は抗酸化経路を制御することで血管石灰化を抑制した

NRF2-suppressed vascular calcification by regulating the antioxidant pathway in chronic kidney disease.

抄録

血管平滑筋細胞（VSMC）が分化して骨形成に移行する血管石灰化（VC）は、慢性腎臓病（CKD）の一般的な合併症である。最近の知見では、核因子-erythroid-2関連因子2（NRF2）は、進化的に保存された抗酸化物質であり、血管老化や石灰化の予防に有益であることがわかっている。しかし、CKDにおける血管の老化や石灰化の進行にNRF2がどのように関与しているかについては、さらなる検討が必要である。CKDに伴うVCモデルラットでは、NRF2、NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1 (NQO1)、アルカリホスファターゼ (ALP)、ラント関連転写因子-2 (RUNX2)、オステオポンチン (OPN)などの骨形成マーカー、およびβ-カテニンの発現がCKDラットに比べて有意に増加していた。免疫組織化学では、これらの結果をさらに検証した。さらに、ラット大動脈VSMCを単離し、正常対照、リン誘導（Pi）、Pi+NRF2活性化剤DMF、Pi+NRF2阻害剤ML385の4つの処理を行った。4つの処理の活性酸素種(ROS)発生量、マロンジアルデヒド(MDA)含有量、カルシウム沈着量を測定した。NRF2、NQO1、ヘムオキシゲナーゼ1（HO1）のmRNAとタンパク質の発現レベル、および骨形成マーカーであるALP、Runx1、OPN、骨形成タンパク質2（BMP2）、β-カテニンをRT-PCRとウェスタンブロッティングで定量化した。VSMCのアポトーシスはフローサイトメトリーで算出した。in vitroの結果から、細胞内の酸化ストレスや石灰化はNRF2の活性と密接に関連しており、NRF2を活性化することでVSMCの骨形成転移やアポトーシスを有意に抑制できることが示唆された。このように、本研究では、NRF2に関連する抗酸化経路が、酸化ストレスを軽減することで、CKDにおけるVCの発症や進行に積極的に対応し、保護することができることを示した。本研究は、NRF2の抗酸化システムをCKDなどの血管疾患の治療に応用するための知見を提供するものと考えられる。

Vascular calcification (VC), in which vascular smooth muscle cells (VSMCs) undergo differentiation and osteogenic transition, is a common complication of chronic kidney disease (CKD). Recent findings show that nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (NRF2) is an evolutionarily conserved antioxidant and beneficial in preventing vascular senescence and calcification. The roles of NRF2 in the initiation and progression of VC in CKD still need further investigation. CKD-associated VC model rats exhibited significant upregulation of NRF2, NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1 (NQO1), osteogenic markers such as alkaline phosphatase (ALP), runt-related transcription factor-2 (RUNX2) and osteopontin (OPN), and β-catenin compared to CKD rats. Immunohistochemistry further verified these results. In addition, rat aortic VSMCs were isolated and subjected to four treatments: normal control, phosphorus-induced (Pi), Pi + NRF2 activator DMF, and Pi + NRF2 inhibitor ML385. The reactive oxygen species (ROS) generation, malondialdehyde (MDA) content, and calcium deposition of the four treatments were determined. The mRNA and protein expression levels of NRF2, NQO1, and haem oxygenase 1 (HO1) and the osteogenic markers ALP, Runx1, OPN, bone morphogenetic protein 2 (BMP2), and β-catenin were quantified by RT-PCR and western blotting. VSMC apoptosis was calculated by flow cytometry. The in vitro results suggested that intracellular oxidative stress and calcification were closely associated with NRF2 activity and that the activation of NRF2 could significantly suppress osteogenic transition and apoptosis in VSMCs. Thus, this study indicated that the NRF2-related antioxidant pathway can positively respond to and protect against the initiation and progression of VC in CKD by reducing oxidative stress. This study may contribute insights facilitating the application of the NRF2 antioxidative system as a therapeutic treatment for vascular diseases such as CKD.