NRF2/ARE経路の活性化を介したスルフォラファンの酸化ストレスに対する保護効果をヒト顆粒膜細胞で確認

The Protective Effect of Sulforaphane against Oxidative Stress through Activation of NRF2/ARE Pathway in Human Granulosa Cells.

抄録

目的:

スルフォラファン（SFN）は天然のフリーラジカルスカベンジャーであり、NF-E2関連因子2（NF-E2-related factor 2またはNRF2）／抗酸化応答要素（ARE）シグナル経路および下流の抗酸化酵素を介して酸化ストレスを軽減することができる。ここでは、活性酸素種（ROS）の細胞内レベル、細胞死、NRF2-ARE経路を調査することにより、OS誘発性のヒト顆粒膜細胞（GC）におけるSFNの役割を研究することを目的とした。

Objective: Sulforaphane (SFN) is a natural free radical scavenger that can reduce oxidative stress (OS) through mediating nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NF-E2-related factor 2 or NRF2)/antioxidant response element (ARE) signaling pathway and the downstream antioxidant enzymes. Here, we intended to study the role of SFN in OSinduced human granulosa cells (GCs) by investigating the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS), cell death, and NRF2-ARE pathway.

材料と方法:

本実験では，多嚢胞性卵巣症候群（PCOS），子宮内膜症，月経障害，高プロラクチン血症，ホルモン療法の既往歴がなく，月経周期が正常な12名の健康な女性のGCを用いた。GCを分離した後、HOの存在下または非存在下でSFNを処理した後のGCの生存率を調べるために、MTTアッセイを実施しました。フローサイトメトリーを用いて、細胞内の活性酸素生成量とアポトーシス率を測定した。NRF2のmRNAとタンパク質の発現レベル、およびスーパーオキシドディスムターゼ（SOD）とカタラーゼ（CAT）を含む第2相酵素の発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とウェスタンブロッティングで評価した。最後に、SPSSソフトウェアを用いて、一方向性ANOVAと適切なポストホック検定を用いてデータを分析した。有意水準はP<0.05とした。

Materials and Methods: This experimental study was conducted on GCs of 12 healthy women who had normal menstrual cycles with no history of polycystic ovary syndrome (PCOS), endometriosis, menstrual disorders, hyperprolactinemia, or hormonal therapy. After isolation of GCs, the MTT assay was performed to explore GCs viability after treatment with SFN in the presence or absence of HO. Flow cytometry was utilized to determine the intracellular ROS production and the apoptosis rate. Evaluation of the mRNA and protein expression levels of NRF2 and phase II enzymes including superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) was performed by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) and western blotting. Finally, the data were analyzed by SPSS software using One-way ANOVA and the suitable post-hoc test. Significance level was considered as P<0.05.

結果:

GCにSFNを前処理したところ、HO曝露細胞における細胞内活性酸素の産生とアポトーシス率が減少した。さらに、SFN処理は、NRF2とSODのmRNA発現量を増加させた。 また、タンパク質レベルでもNRF2とSODの発現量が増加していた。

Results: Pretreatment of GCs with SFN attenuated intracellular ROS production and apoptosis rate in the HO-exposed cells. Moreover, SFN treatment increased the mRNA expression level of , and . Higher expression of NRF2 and SOD was also observed at the protein level.

結論:

今回の研究では、SFNは、NRF2がSODやCATなどの抗酸化酵素を増加させるメカニズムにより、細胞内の活性酸素産生とそれに続くアポトーシスを減少させ、HOによるOSからヒトGCを保護することが明らかになった。この結果は、特にPCOS患者において、GCや埋没卵子の質を向上させることで、生殖補助サイクルへの応用が期待される。

Conclusion: Our study demonstrated that SFN protects human GCs against HO induced-OS by reducing the intracellular ROS production and the following apoptosis through a mechanism by which NRF2 increases the antioxidant enzymes such as SOD and CAT. This result may have a potential application in assisted reproduction cycles by improving the quality of GCs and the embedded oocyte, especially in PCOS patients.