Porphyromonas gingivalisが分泌するジンジパインは、タイトジャンクションタンパク質の細胞内分解を介してヒト脳微小血管内皮細胞の透過性を増加させることを明らかにした

Secreted gingipains from Porphyromonas gingivalis increase permeability in human cerebral microvascular endothelial cells through intracellular degradation of tight junction proteins.

抄録

歯周病菌の脳への浸潤とアルツハイマー病（AD）における認知機能の低下との間には明確な相関関係があるにもかかわらず、細菌が血液脳関門（BBB）を通過する正確なメカニズムはまだ明らかになっていない。歯周病菌であるPorphyromonas gingivalisは、ジンジパインと呼ばれるユニークなクラスのシステインプロテアーゼを産生する。ジンジパインは、散発性ADを悪化させる重要な病原体であると考えられている。我々は、ジンジパインが、zonula occludens (ZO-1) や occludin などのタイトジャンクションタンパク質の分解を介して、ヒト脳微小血管内皮細胞株である hCMEC/D3 細胞の透過性を高めることを報告する。hCMEC/D3細胞に野生型（WT）のP. gingivalisを感染させると、ZO-1とオクルディンのタンパク質レベルの平均値が有意に低下していた。しかし、ジンジパイン欠損P. gingivalis株を感染させると、WT株に比べてZO-1とオクルディンの平均タンパク質量の減少が有意に少なかった。また、WT株およびジンジパイン欠損P. gingivalis株の培養上清で処理しても同様の結果が得られた。ジンジパイン阻害剤の非存在下および存在下でのWT P. gingivalis培養上清によるヒト組換えZO-1およびオクルディンのin vitro消化は、ジンジパインがこれらのタイトジャンクションタンパク質を直接分解することを示していた。さらに、抗ジンジパイン抗体を用いた免疫組織化学的検査により、WT P. gingivalisを感染させ、その培養上清で処理したhCMEC/D3細胞では、ジンジパインが細胞質や核に局在することが明らかになった。さらに、WT P. gingivalis由来のジンジパインが結合した外膜小胞（OMV）の細胞内への局在や、OMVによるZO-1やオクルディンの分解も観察された。このことから、脳微小血管内皮細胞へのジンジパインの導入は、おそらくOMVを介して行われ、細胞内でのZO-1とオクルディンの分解を介してBBBの損傷に関与していると考えられる。

Despite a clear correlation between the infiltration of periodontal pathogens in the brain and cognitive decline in Alzheimer's disease (AD), the precise mechanism underlying bacteria crossing the blood-brain barrier (BBB) remains unclear. The periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis produces a unique class of cysteine proteases termed gingipains. Gingipains appear to be key virulence factors that exacerbate sporadic AD. We herein report that gingipains are involved in increasing permeability of hCMEC/D3 cell monolayer, human cerebral microvascular endothelial cell lines, through degradation of tight junction proteins including zonula occludens (ZO-1) and occludin. There was a significant decrease in the mean protein levels of ZO-1 and occludin after infection of hCMEC/D3 cells with wild-type (WT) P. gingivalis. However, infection of these cells with a gingipain-deficient P. gingivalis strain showed significantly lower reduction of the mean protein levels of either ZO-1 and occludin, compared to the WT strain. Similar results were obtained after treatment with culture supernatant from WT and gingipain-deficient P. gingivalis strains. In vitro digestion of human recombinant ZO-1 and occludin by WT P. gingivalis culture supernatant in the absence or presence of gingipain inhibitors indicated that gingipains directly degraded these tight junction proteins. A close immunohistochemical examination using anti-gingipain antibody further revealed that gingipains localized in the cytosol and nuclei of hCMEC/D3 cells after infection with WT P. gingivalis and treatment with its culture supernatant. Furthermore, intracellular localization of outer membrane vesicles (OMVs) bound gingipains from WT P. gingivalis and OMV-induced degradation of ZO-1 and occludin were also observed in hCMEC/D3 cells. Thus, the delivery of gingipains into the cerebral microvascular endothelial cells, probably through OMV, may be responsible for the BBB damage through intracellular degradation of ZO-1 and occludin.