ゲノムのナノポアシークエンスのためのDNA分離法

DNA isolation methods for Nanopore sequencing of the genome.

抄録

は、口腔内常在菌の一種であり、感染性心内膜炎、菌血症、敗血症などの病気の原因となることもあるグラム陽性菌です。ゲノムには高度な組換え性と反復性があるため、短いシーケンスリードだけでは完全なゲノムを組み立てることができません。オックスフォード・ナノポア・シーケンサーは、この限界を克服するために、長いリードを生成することで、ゲノムの繰り返し領域を解決し、完全なゲノム配列を組み立てることができます。ナノポアシーケンシングの出力は、ゲノムDNAの品質と分子量に大きく影響されるため、最適なシーケンシングを行うためには、DNAの分離が重要なステップとなります。本研究では、3種類のDNA単離方法を2つの菌株に設定して比較し、ゲノムDNAの完全性と純度を維持する能力を評価しました。機械的溶解法で分離したDNAのシーケンスは、安価で迅速であるにもかかわらず、超長尺のリード（最大リード長59516塩基）が得られず、円形の完全なゲノムをアセンブルすることができなかった。一方、細菌の細胞壁を酵素で溶解した後、(i)CTABを用いたDNA分離法、または(ii)プロトプラストを浸透圧で溶解した後にDNAを精製する2つの方法では、それぞれ最大107294塩基、181199塩基の超長塩基配列を得ることができた。また、酵素溶解法で分離したDNAを用いて、円形の完全なゲノムを再構築することができた。

is a Gram-positive bacterium, member of the oral commensal microbiota, which can occasionally be the etiologic agent of diseases such as infective endocarditis, bacteraemia and septicaemia. The highly recombinogenic and repetitive nature of the genome impairs the assembly of a complete genome relying only on short sequencing reads. Oxford Nanopore sequencing can overcome this limitation by generating long reads, enabling the resolution of genomic repeated regions and the assembly of a complete genome sequence. Since the output of a Nanopore sequencing run is strongly influenced by genomic DNA quality and molecular weight, the DNA isolation is the crucial step for an optimal sequencing run. In the present work, we have set up and compared three DNA isolation methods on two strains, evaluating their capability of preserving genomic DNA integrity and purity. Sequencing of DNA isolated with a mechanical lysis-based method, despite being cheaper and quicker, did not generate ultra-long reads (maximum read length of 59516 bases) and did not allow the assembly of a circular complete genome. Two methods based on enzymatic lysis of the bacterial cell wall, followed by either (i) a modified CTAB DNA isolation procedure, or (ii) a DNA purification after osmotic lysis of the protoplasts allowed the sequencing of ultra-long reads up to 107294 and 181199 bases in length, respectively. The reconstruction of a circular complete genome was possible sequencing DNAs isolated using the enzymatic lysis-based methods.