希少または非天然カロテノイドを生産するための新規生合成経路を創出するための酵素の有向進化を利用する

Use of directed enzyme evolution to create novel biosynthetic pathways for production of rare or non-natural carotenoids.

抄録

近年、生物工学や合成生物学の技術の進歩により、実験室内でカロテノイドの多様性を生み出すことができるようになった。本章では、カロテノイド生合成酵素の有向進化を行うための方法を順を追って説明する。まず、大腸菌による効率的なコロニー型スクリーニングの確立方法について、プラスミドDNA構築設計の詳細な説明と、安定なコロニーを作るための細胞の取り扱いや操作のコツを含めて説明する。また、有向進化実験の例として、細菌のフィトエンデサチュラーゼCrtIを操作し、非天然型長鎖カロテノイドの生成を触媒するC-フィトエンデサチュラーゼを得る方法を紹介している。本章で述べた方法は、近年のゲノムの進歩により急速にその数を増やしている多くのカロテノイド生合成酵素に適用することが可能である。カロテノイド酵素に定向進化を用いることは、新規カロテノイドの発見のみならず、自然界におけるカロテノイド生合成経路の創出と進化に関するより深い理解に寄与するものと思われる。

In recent years, advances in bioengineering and synthetic biology techniques have been used to create carotenoid diversity in the laboratory. In this chapter, we describe the step-by-step method to perform directed evolution of carotenoid biosynthetic enzymes. We first explain how to establish an efficient Escherichia coli colony-based screening, including a detailed description of plasmid DNA construction design as well as tips and tricks to handle and manipulate cells to produce stable colonies. As an example for the directed evolution experiment, we engineer a bacterial phytoene desaturase CrtI to obtain a C-phytoene desaturase, which catalyzes formation of a non-natural long-chain carotenoid. The method described in this chapter can be applied to many carotenoid biosynthetic enzymes, whose numbers have been rapidly expanding with recent advances in genomics. The use of directed evolution for carotenoid enzymes will contribute not only to the discovery of novel carotenoids but also to a deeper understanding of the creation and evolution of carotenoid biosynthetic pathways in nature.