バイオミメティック・スフェロイド培養モデルにおける体外骨形成時の生理的なミネラリゼーション

Physiological Mineralization during In Vitro Osteogenesis in a Biomimetic Spheroid Culture Model.

抄録

骨粗鬆症治療薬の開発戦略は、依然として劣悪な2D in vitroスクリーニングに依存しています。我々は、より生理的なハイスループット・スクリーニングのために、足場がない前駆細胞ベースの3Dバイオミネラリゼーションモデルの開発を目指した。MC3T3-E1前骨芽細胞を10% FCS添加α-MEMで37℃、5% COで28日間培養し、非付着性のV字プレートで均一な大きさの3Dスフェロイドを形成させた。10 mM β-グリセロリン酸および50 µg/mLアスコルビン酸により骨形成が誘導された。マーカー遺伝子の発現、アルカリホスファターゼ活性、カルシウム沈着量を組織化学的に調べ、ミネラリゼーションステージを評価した。また，FTIR（Fourier transformed infrared）およびSEM（Scanning electron microscopic）分析により石灰化の質を評価し，マイクロCT分析により定量化した．初期および後期の骨芽細胞分化マーカーの発現プロファイルは、I型コラーゲンおよびオステオカルシン陽性の免疫組織化学（IHC）、およびmRNAレベルの強い上昇を示し、3Dバイオミネラリゼーションプロセスがよく発達していることを示した。また，培養の後半には，ミネラル濃度の上昇を伴うダイナミックなバイオミネラリゼーションプロセスが観察された．SEM-エネルギー分散型X線分析（EDX）およびFTIRにより、生体内で骨類似のハイドロキシアパタイト鉱物が沈着していることが最終的に確認された。このように、薬理学的な生体外スクリーニングを向上させるために、強固で汎用性のある生体模倣型、ハイスループット対応、コスト効率の高い骨類似鉱物のスフェロイド培養モデルを確立しました。

Bone health-targeting drug development strategies still largely rely on inferior 2D in vitro screenings. We aimed at developing a scaffold-free progenitor cell-based 3D biomineralization model for more physiological high-throughput screenings. MC3T3-E1 pre-osteoblasts were cultured in α-MEM with 10% FCS, at 37 °C and 5% CO for up to 28 days, in non-adherent V-shaped plates to form uniformly sized 3D spheroids. Osteogenic differentiation was induced by 10 mM β-glycerophosphate and 50 µg/mL ascorbic acid. Mineralization stages were assessed through studying expression of marker genes, alkaline phosphatase activity, and calcium deposition by histochemistry. Mineralization quality was evaluated by Fourier transformed infrared (FTIR) and scanning electron microscopic (SEM) analyses and quantified by micro-CT analyses. Expression profiles of selected early- and late-stage osteoblast differentiation markers indicated a well-developed 3D biomineralization process with strongly upregulated , and mRNA levels and type I collagen- and osteocalcin-positive immunohistochemistry (IHC). A dynamic biomineralization process with increasing mineral densities was observed during the second half of the culture period. SEM-Energy-Dispersive X-ray analyses (EDX) and FTIR ultimately confirmed a native bone-like hydroxyapatite mineral deposition ex vivo. We thus established a robust and versatile biomimetic, and high-throughput compatible, cost-efficient spheroid culture model with a native bone-like mineralization for improved pharmacological ex vivo screenings.