ヒト歯根のガラス固化凍結保存による自家歯牙組織バンク化

Cryopreservation of human dental roots using vitrification for autologous human tooth tissue banking.

抄録

本研究の目的は、ヒト歯根の形態、微小硬度、細胞のアポトーシス、増殖および分化に関するガラス化凍結保存の影響を調べることにより、ガラス化凍結保存した歯組織の自家移植の実現可能性を予備的に評価することである。ヒト永久歯小臼歯を抜歯し、歯冠を除去した新鮮な歯根を採取した。歯根は市販のガラス化培地（北里酸）を用いて凍結保存した。液体窒素中で6ヵ月間保存した後、凍結保存した歯根を解凍し、組織学的および免疫組織化学的手法を用いて評価した。象牙質の微小硬度はビッカース圧子を用いて測定した。歯根膜組織と歯髄組織の細胞を単離し、その特性を調べた。凍結保存した歯根から分離した細胞の増殖、免疫表現型、アポトーシス、分化能を評価した。データは一元配置分散分析（ANOVA）とスチューデントのt検定を用いて分析した。歯根の肉眼的および組織学的形態は、ガラス固化および融解後に有意な変化は認められなかった。凍結保存された全10サンプルのうち3サンプルにわずかな亀裂が認められた。SEM観察では、歯質の微細構造に明らかな変化は認められなかった。凍結保存したヒト歯根の組織から歯髄細胞および歯根膜細胞の分離に成功した。また、歯根膜細胞の形態、免疫型、生存率、増殖およびアポトーシスに関して、両群で有意差は認められなかった。歯根膜細胞の骨形成および脂肪形成分化能は、ガラス化凍結保存により維持された。本研究の条件下では、ガラス化凍結保存は、細胞の生存、歯根の硬度および構造的完全性を維持する。ガラス固化は、将来の自家移植や自家細胞治療のために歯組織を保存する潜在的な方法となりうる。

This study aims to preliminarily evaluate the feasibility of autologous transplantation of tooth tissues cryopreserved with vitrification, by investigating the influence of cryopreservation with vitrification on human dental root, regarding the morphology, microhardness, cell apoptosis, proliferation and differentiation. Freshly extracted human permanent premolars were collected with crown removed. Dental roots were cryopreserved using a commercial vitrification medium (Kitazatousa). After six-month storage in liquid nitrogen, cryopreserved roots were thawed, and then evaluated using histological and immunohistochemical methods. Microhardness of dentine was measured with a Vickers indenter. Cells in periodontal ligament and dental pulp tissues were isolated and characterized. The proliferation, immunophenotype, apoptosis and differentiation ability of cells isolated from cryopreserved roots were evaluated. The data was analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) and Student's t-test. The gross and histological morphology of dental roots was not significantly changed after vitrification and thawing. A few tiny cracks were found in 3 of all 10 cryopreserved samples. No obvious changes were found in microstructure of dentine under SEM observation. Dental pulp cells and periodontal ligament cells were successfully isolated from tissues of cryopreserved human dental roots. There were also no significant differences of those periodontal ligament cells in the two groups regarding morphology, immunophenotype, viability, proliferation and apoptosis. The osteogenic and adipogenic differentiation capability of periodontal ligament cells was maintained by cryopreservation with vitrification. In the conditions of this study, cryopreservation with vitrification preserves cell survival, hardness and structural integrity of dental roots. Vitrification can be a potential way to preserve tooth tissue for future auto-transplantation and autologous cell therapy.