超臨界CO滅菌ナノハイドロキシアパタイト/キトサン生分解性スキャフォールドの歯周骨再生における物理化学的および生体適合性の完全な特性化

Full physicochemical and biocompatibility characterization of a supercritical CO sterilized nano-hydroxyapatite/chitosan biodegradable scaffold for periodontal bone regeneration.

抄録

骨は生来自己再生能力を有するにもかかわらず、歯周病や外傷による欠損の大きさによっては、自然な再生が阻害される場合がある。本研究では、ナノハイドロキシアパタイト/キトサン（nHAp/CS、70/30）多孔質生分解性歯周骨再生用足場を作製し、最終溶媒抽出と超臨界CO（scCO）による滅菌を行う方法を確立しました。マイクロCT解析により、骨再生に重要なnHAp/CSの多孔質微細構造（全空隙率78%、中孔径200μm）を明らかにした。走査型電子顕微鏡（SEM）により、模擬体液中21日後にnHAp/CS足場の表面にHAp結晶が形成されていることが確認され、in vitroでの生物活性が実証されました。nHApが存在することで、PBS中のCS足場と比較して、生分解速度が著しく低下した。動的力学解析により粘弾性を確認したが、nHApの存在により貯蔵弾性率が有意に向上し（PBS中28日後、10Hzで42.34±6.09kPa）、低荷重骨欠損における骨吸収をサポートする可能性が示唆された。両足場ともS. aureusとE. coliの増殖、付着、コロニー形成能力を著しく阻害し、自然汚染された口腔環境における移植片の組成におけるキトサンの関連性を高めた。SEMおよびレーザー走査型共焦点顕微鏡では、MG63細胞は正常な形態を示し、バイオマテリアルの多孔質構造内、特にnHAp/CS足場内に接着し増殖することができ、14日目には高い増殖率に到達した。nHAp/CS足場内に播種したMG63細胞は、CSサンプルと比較して、RUNX2、コラーゲンA1、Sp7骨形成遺伝子の高い発現量を示した。両方の足場をマウスに皮下移植した場合、生分解性は低く、足場の多孔質構造は5週間まで維持され、結合組織の生育を可能にした。組織学的には、特にnHAp/CSスキャフォールドでは、3週間から5週間の間に新しい血管とコラーゲンが集中的かつ段階的に生育していることが示されました。これまでのところ、scCO法により、費用対効果が高く、環境にやさしい、すぐに使用できるnHAp/CSスキャフォールドを製造することができた。このスキャフォールドは、微細構造、化学的、機械的、生体適合性の特徴を持ち、歯周炎やインプラント周囲炎などの悪環境下で欠損部位に適した骨移植の代替となるものである。

Despite bone's innate self-renewal capability, some periodontal pathologic and traumatic defects' size inhibits full spontaneous regeneration. This current research characterized a 3D porous biodegradable nano-hydroxyapatite/chitosan (nHAp/CS, 70/30) scaffold for periodontal bone regeneration, which preparation method includes the final solvent extraction and sterilization through supercritical CO (scCO). Micro-CT analysis revealed the fully interconnected porous microstructure of the nHAp/CS scaffold (total porosity 78 %, medium pore size 200 μm) which is critical for bone regeneration. Scanning electron microscopy (SEM) showed HAp crystals forming on the surface of the nHAp/CS scaffold after 21 days in simulated body fluid, demonstrating its bioactivity in vitro. The presence of nHAp in the scaffolds promoted a significantly lower biodegradation rate compared to a plain CS scaffold in PBS. Dynamic mechanical analysis confirmed their viscoelasticity, but the presence of nHAp significantly enhanced the storage modulus (42.34 ± 6.09 kPa at 10 Hz after 28 days in PBS), showing that it may support bone ingrowth at low-load bearing bone defects. Both scaffold types significantly inhibited the growth, attachment and colony formation abilities of S. aureus and E. coli, enhancing the relevance of chitosan in the grafts' composition for the naturally contaminated oral environment. At SEM and laser scanning confocal microscopy, MG63 cells showed normal morphology and could adhere and proliferate inside the biomaterials' porous structure, especially for the nHAp/CS scaffold, reaching higher proliferative rate at day 14. MG63 cells seeded within nHAp/CS scaffolds presented a higher expression of RUNX2, collagen A1 and Sp7 osteogenic genes compared to the CS samples. The in vivo subcutaneous implantation in mice of both scaffold types showed lower biodegradability with the preservation of the scaffolds porous structure that allowed the ingrowth of connective tissue until 5 weeks. Histology shows an intensive and progressive ingrowth of new vessels and collagen between the 3 and the 5 week, especially for the nHAp/CS scaffold. So far, the scCO method enabled the production of a cost-effective and environment-friendly ready-to-use nHAp/CS scaffold with microstructural, chemical, mechanical and biocompatibility features that make it a suitable bone graft alternative for defect sites in an adverse environment as in periodontitis and peri-implantitis.