ファブリー病におけるLyso-Gb3の毒性作用と疾患メカニズムの解明

Elucidating the toxic effect and disease mechanisms associated with Lyso-Gb3 in Fabry disease.

抄録

ファブリー病は、α-ガラクトシダーゼの欠損により、グロボトリアオシルセラミド（Gb3）が蓄積されます。しかし、その脱アシル化体であるグロボトリアオシルスフィンゴシン（lyso-Gb3）の生成も認められ、その血漿中濃度は病気の重症度とより密接に関連している。リゾGb3はポドサイトに直接作用し、末梢の侵害受容ニューロンの感作を引き起こすことが研究で示されています。しかし、この細胞毒性のメカニズムについてはほとんど分かっていない。神経細胞への影響を調べるため、SH-Sy5y細胞を、軽度および古典的なFD血清レベルを模倣した低レベル（20ng/mL）および高レベル（200ng/mL）のリゾGb3とともにインキュベートしました。lyso-Gb3の特異的な効果を調べるために、陽性対照としてグルコシルスフィンゴシンを使用した。プロテオーム解析の結果、lyso-Gb3が影響を及ぼす細胞システムには、細胞シグナル伝達、特にタンパク質のユビキチン化、タンパク質翻訳が含まれていることが判明した。小胞体/プロテアソームへの影響を確認するため、ユビキチン化タンパク質の免疫濃縮を行ったところ、両投与量においてユビキチン化タンパク質が特異的に増加することが示されました。最もユビキチン化されたタンパク質は、シャペロン/熱ショックタンパク質、細胞骨格タンパク質、合成/翻訳タンパク質であった。lyso-Gb3と直接相互作用するタンパク質を検出するために、lyso-脂質を固定化し、神経細胞抽出物とインキュベートし、質量分析法を用いて結合したタンパク質を同定した。特異的に結合したタンパク質はシャペロンであり、HSP90、HSP60、TRiC複合体が含まれた。結論として、lyso-Gb3への暴露は、タンパク質の翻訳とフォールディングに関わる経路に影響を与える。この反応は、ユビキチン化の増加やシグナル伝達タンパク質の変化として観察され、FDにしばしば関連する複数の生物学的プロセス、特に細胞リモデリングを説明することができる。

Fabry disease results from a deficiency of alpha-galactosidase and results in accumulation of Globotriaosylceramide (Gb3). However, the production of its deacylated form globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3) is also observed and its plasma levels have closer association with disease severity. Studies have shown lyso-Gb3 directly affects podocytes and causes sensitisation of peripheral nociceptive neurons. However, little is understood of the mechanisms of this cytotoxicity. To study the effect on neuronal cells, we incubated SH-Sy5y cells with lyso-Gb3 at low (20 ng/mL) and high (200 ng/mL) levels, to mimic mild and classical FD serum levels. We used glucosylsphingosine as a positive control to determine specific effects of lyso-Gb3. Proteomic analyses revealed that cellular systems affected by lyso-Gb3 included cell signalling particularly protein ubiquitination and protein translation. To confirm ER/proteasome perturbations we performed an immune-enrichment of ubiquitinated proteins and demonstrated specific increased protein ubiquitination at both doses. The most ubiquitinated proteins observed included the chaperone/heat shock proteins, cytoskeletal proteins and synthesis/translation proteins. To detect proteins that interact directly with lyso-Gb3, we immobilised lyso-lipids, then incubated them with neuronal cellular extracts and identified bound proteins using mass spectrometry. Proteins that specifically bound were chaperones and included HSP90, HSP60 and the TRiC complex. In conclusion, lyso-Gb3 exposure affects pathways involved in protein translation and folding. This response is observed as increased ubiquitination and changes in signalling proteins which may explain the multiple biological processes, particularly cellular remodelling, often associated with FD.