選択された4つのエピジェネティッククロックの基礎となる標的シトシンマーカーのDNAメチル化を定量するためのマルチプレックスアンプリコンシーケンスアッセイの導入

Introduction of a multiplex amplicon sequencing assay to quantify DNA methylation in target cytosine markers underlying four selected epigenetic clocks.

抄録

背景:

DNAメチル化解析は年齢評価のための強力なツールであることが証明されている。しかし、エピジェネティックな年齢予測を診断や日常的な法医学的ケースワークで実施するには、適切な検査方法が必要である。本研究では、精度、スループット、多重化能力、高感度という点で有望な大規模DNAメチル化解析プロトコルの性能を比較することを目的とした。

BACKGROUND: DNA methylation analysis has proven to be a powerful tool for age assessment. However, the implementation of epigenetic age prediction in diagnostics or routine forensic casework requires appropriate laboratory methods. In this study, we aimed to compare the performance of large-scale DNA methylation analysis protocols that show promise in terms of accuracy, throughput, multiplexing capacity, and high sensitivity.

結果:

プロトコルは、エピジェネティックな加齢関連パラメータの4つの既知の推定因子から、161のゲノムCG/CA部位をターゲットとするよう事前に定義されたパネルを設計し、最適化し、人為的にメチル化したコントロールまたは血液サンプルを用いて検証した。我々は、2つの濃縮プロトコルを用いて、これらの遺伝子座の96％を標的とすることに成功した：Ion AmpliSeq™はIon Torrent S5と統合されたアンプリコンベースの手法であり、SureSelect Methyl-Seqはハイブリダイゼーションベースの手法の後にMiSeq FGxシーケンシングを行うものである。どちらのプロトコルも高い精度と頑健性を示しました。ハイブリダイゼーションアッセイは多重化能力が高いが、アンプリコンベースのプロトコルで最高の総合的な性能が観察され、25ngの出発DNAでDNAメチル化の変動が最も小さく、観察されたマーカーカバレッジの平均は～6.7kリード、メチル化の定量精度は、観察されたメチル化と予想されたメチル化のベータ値の差の平均絶対値が0.054であった。Ion AmpliSeq法は、ゲノムスケールのEPICマイクロアレイデータと強い相関を示し（R=0.91）、メチル化測定精度の点で優位性を示した。手法間のバイアスは線形変換の使用によって説明され、使用されたVISAGEおよびHannum年齢時計の平均絶対誤差は5年未満で、高精度の暦年齢予測が得られた。我々のパネルに含まれる加齢ペース（PoAm）および死亡リスクスコア（MRS）推定式は、次世代クロックを代表し、VISAGEおよびHannumモデルとの相関は低いか中程度（R<0.75）であることが判明し、したがってエピジェネティック加齢の異なる側面を捉えている可能性がある。

RESULTS: The protocols were designed to target a predefined panel of 161 genomic CG/CA sites from four known estimators of epigenetic age-related parameters, optimized and validated using artificially methylated controls or blood samples. We successfully targeted 96% of these loci using two enrichment protocols: Ion AmpliSeq™, an amplicon-based method integrated with Ion Torrent S5, and SureSelect Methyl-Seq, a hybridization-based method followed by MiSeq FGx sequencing. Both protocols demonstrated high accuracy and robustness. Although hybridization assays have greater multiplexing capabilities, the best overall performance was observed for the amplicon-based protocol with the lowest variability in DNA methylation at 25 ng of starting DNA, mean observed marker coverage of ~ 6.7 k reads, and accuracy of methylation quantification with a mean absolute difference between observed and expected methylation beta value of 0.054. The Ion AmpliSeq method correlated strongly with genome-scale EPIC microarray data (R = 0.91) and showed superiority in terms of methylation measurement accuracy. Method-to-method bias was accounted for by the use of linear transformation, which provided a highly accurate prediction of calendar age with a mean absolute error of less than 5 years for the VISAGE and Hannum age clocks used. The pace of aging (PoAm) and the mortality risk score (MRS) estimators included in our panel represent next-generation clocks, were found to have low to moderate correlations with the VISAGE and Hannum models (R < 0.75), and thus may capture different aspects of epigenetic aging.

結論:

我々は、4つの異なるクロックの基礎となるシトシンのDNAメチル化を定量化できるラボ用ツールを提案する。このツールは、エピジェネティックな老化に関する幅広い情報を提供すると同時に、CpGマーカーの数を合理的に維持し、法医学、医学、ヘルスケアにおける幅広い応用への道を開くものである。

CONCLUSIONS: We propose a laboratory tool that allows the quantification of DNA methylation in cytosines underlying four different clocks, thus providing broad information on epigenetic aging while maintaining a reasonable number of CpG markers, opening the way to a wide range of applications in forensics, medicine, and healthcare.