アセラーおよび細胞負荷ベータ細胞代替デバイスのin vitro酸素イメージング

In vitro oxygen imaging of acellular and cell-loaded beta cell replacement devices.

抄録

1型糖尿病（T1D）は、インスリンを産生するβ細胞が失われる自己免疫疾患である。バイオ人工膵臓（BAP）またはβ細胞置換戦略は、T1Dを治癒し、長期的なインスリン自立をもたらすことが期待されている。移植後の初期段階で細胞の酸素消費によりBAP装置内で起こりうる低酸素症（低酸素濃度）は、細胞を損傷させるだけでなく、有望な結果をげっ歯類からヒトに移植する際に装置の寸法に制限を課す。細胞に十分な酸素を供給する方法を見つけることは、BAPデバイスの可能性をフルに発揮させる上で、依然として大きな課題である。したがって、BAPデバイスのin vitro酸素イメージング評価は、デバイスのin vivo効率を予測する上で極めて重要である。電子常磁性共鳴酸素イメージング（EPROI、電子MRIまたはeMRIとしても知られる）は、絶対酸素分圧（pO）マップを提供するユニークなイメージング技術であり、数十年にわたりがんの低酸素研究に用いられてきた。しかし、BAP装置の評価への応用は検討されていない。EPROIは、mT範囲の低磁場、静的勾配、およびトリチルOX071のような酸素感受性スピンプローブのスピン-格子緩和率（R）とpOの間の線形関係を利用して、組織内の酸素マップを作成する。産学連携コンソーシアムである若年性糖尿病研究基金（JDRF）の支援により、O2Mに「酸素計測コア」が設立され、コアメンバーの研究室から発信されたBAPデバイスの酸素イメージング評価を実施している。本稿の目的は、EPROIを用いたBAPデバイスのin vitro酸素イメージングについて、プロトコルを確立し、いくつかの例を示すことである。すべてのpO測定は、最近導入された720MHz/25mT前臨床酸素イメージャー装置JIVA-25™を用いて行われた。そのようなデータが存在しないため、まずBAPに使用される生体材料のpOキャリブレーションを25mT磁場で実施した。いくつかの選択した材料について、EPROI pO測定とシングルポイントプローブを比較した。また、線維芽細胞やインスリン産生細胞（βTC6、MIN6、ヒト膵島細胞）を用いたトリチルOX071毒性試験も行った。最後に、サイズ、形状、生体材料の異なる5種類のBAPデバイスのin vitro pOイメージングを行い、概念実証を行った。EPROIは一般的に使用されている生体材料と適合性があり、トリチルOX071は細胞に対して無毒であることが実証された。選択した生体材料におけるEPROIと蛍光ベースの点状酸素プローブの比較では、EPROIの方が精度が高いことが示された。典型的な不均質BAPデバイスのイメージングにより、単一点測定よりも酸素マップを得ることの有用性が示された。要約すると、我々はEPROIを、効率的な細胞移植装置や人工組織移植片を開発するための品質管理ツールとして紹介する。この研究の焦点は糖尿病用カプセル化システムであるが、このプロジェクトで開発された技術は、組織工学・再生医療（TERM）分野で使用される他の生体材料、組織移植片、細胞治療デバイスに容易に移植可能である。まとめると、EPROIは、細胞移植デバイスや人工組織における酸素分布を実験的に研究するためのユニークな非侵襲的ツールであり、T1Dのような変性疾患の治療に革命をもたらす可能性がある。

Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that leads to the loss of insulin-producing beta cells. Bioartificial pancreas (BAP) or beta cell replacement strategies have shown promise in curing T1D and providing long-term insulin independence. Hypoxia (low oxygen concentration) that may occur in the BAP devices due to cell oxygen consumption at the early stages after implantation damages the cells, in addition to imposing limitations to device dimensions when translating promising results from rodents to humans. Finding ways to provide cells with sufficient oxygenation remains the major challenge in realizing BAP devices' full potential. Therefore, in vitro oxygen imaging assessment of BAP devices is crucial for predicting the devices' in vivo efficiency. Electron paramagnetic resonance oxygen imaging (EPROI, also known as electron MRI or eMRI) is a unique imaging technique that delivers absolute partial pressure of oxygen (pO) maps and has been used for cancer hypoxia research for decades. However, its applicability for assessing BAP devices has not been explored. EPROI utilizes low magnetic fields in the mT range, static gradients, and the linear relationship between the spin-lattice relaxation rate (R) of oxygen-sensitive spin probes such as trityl OX071 and pO to generate oxygen maps in tissues. With the support of the Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), an academic-industry partnership consortium, the "Oxygen Measurement Core" was established at O2M to perform oxygen imaging assessment of BAP devices originated from core members' laboratories. This article aims to establish the protocols and demonstrate a few examples of in vitro oxygen imaging of BAP devices using EPROI. All pO measurements were performed using a recently introduced 720 MHz/25 mT preclinical oxygen imager instrument, JIVA-25™. We began by performing pO calibration of the biomaterials used in BAPs at 25 mT magnetic field since no such data exist. We compared the EPROI pO measurement with a single-point probe for a few selected materials. We also performed trityl OX071 toxicity studies with fibroblasts, as well as insulin-producing cells (beta TC6, MIN6, and human islet cells). Finally, we performed proof-of-concept in vitro pO imaging of five BAP devices that varied in size, shape, and biomaterials. We demonstrated that EPROI is compatible with commonly used biomaterials and that trityl OX071 is nontoxic to cells. A comparison of the EPROI with a fluorescent-based point oxygen probe in selected biomaterials showed higher accuracy of EPROI. The imaging of typically heterogenous BAP devices demonstrated the utility of obtaining oxygen maps over single-point measurements. In summary, we present EPROI as a quality control tool for developing efficient cell transplantation devices and artificial tissue grafts. Although the focus of this work is encapsulation systems for diabetes, the techniques developed in this project are easily transferable to other biomaterials, tissue grafts, and cell therapy devices used in the field of tissue engineering and regenerative medicine (TERM). In summary, EPROI is a unique noninvasive tool to experimentally study oxygen distribution in cell transplantation devices and artificial tissues, which can revolutionize the treatment of degenerative diseases like T1D.