マウスマクロファージ様RAW-ASC細胞における炎症性サイトカイン産生に対するToll様受容体2リガンドとアレンドロネートの相乗効果は、MyD88発現のアップレギュレーションを伴う

Synergistic effect of Toll-like receptor 2 ligands and alendronate on proinflammatory cytokine production in mouse macrophage-like RAW-ASC cells is accompanied by upregulation of MyD88 expression.

抄録

目的:

Toll様受容体（TLR）は、細胞全体または微生物の成分を認識する。アレンドロネート（ALN）は抗骨吸収薬であるが、炎症性の副作用がある。本研究の目的は、ALNがTLR2リガンド誘導性の炎症性サイトカイン産生を増強するかどうかを、カスパーゼリクルーティングドメイン（ASC）遺伝子を含むマウスapoptosis-associated speck-like proteinを導入したマウスマクロファージ様RAW264.7細胞（以下、「RAW-ASC細胞」と呼ぶ）を用いて検討することであった。

OBJECTIVES: Toll-like receptors (TLRs) recognize whole cells or components of microorganisms. Alendronate (ALN) is an anti-bone-resorptive drug that has inflammatory side effects. The aim in this study was to examine whether ALN augments TLR2 ligand-induced proinflammatory cytokine production using mouse macrophage-like RAW264.7 cells transfected with murine apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) gene (hereafter, referred to as "RAW-ASC cells").

方法:

RAW-ASC細胞をALNで前処理した後、TLR2リガンドでインキュベートした。培養上清中のマウスIL-1α、IL-1β、IL-6、および腫瘍壊死因子α（TNF-α）の分泌レベル、ならびに活性化因子タンパク質-1（AP-1）または核因子-κB（NF-κB）の活性化を、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）を用いて測定した。骨髄分化因子 88（MyD88）、カスパーゼ-11、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様レセプターファミリーピリン ドメイン含有 3（NLRP3）、ASC、NF-κB p65、およびアクチンの発現は、ウェスタンブロッティングにより分析した。TLR2の発現はフローサイトメトリーで解析した。

METHODS: RAW-ASC cells were pretreated with or without ALN and then incubated with or without TLR2 ligands. The levels of secreted mouse IL-1α, IL-1β, IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in culture supernatants and the activation of activator protein-1 (AP-1) or nuclear factor-κB (NF-κB) were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of myeloid differentiation factor 88 (MyD88), caspase-11, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3), ASC, NF-κB p65, and actin were analyzed via Western blotting. TLR2 expression was analyzed using flow cytometry.

結果:

ALNは、RAW-ASC細胞におけるPamCSK誘導性のIL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-αの放出およびMyD88の発現を大幅に上昇させた。MyD88阻害剤であるST-2825は、ALNによって増強されたこれらのサイトカインの放出を阻害した。ALNの前処理は、RAW-ASC細胞におけるPamCSK誘発NF-κB活性化を増強し、AP-1活性化を上昇させた。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）Sタンパク質とALNは、RAW-ASC細胞においてIL-1α、IL-1β、IL-6およびTNF-αの放出を相乗的に増大させた。

RESULTS: ALN substantially upregulated the PamCSK-induced release of IL-1α, IL-1β, IL-6, and TNF-α and MyD88 expression in RAW-ASC cells. ST-2825, a MyD88 inhibitor, inhibited the ALN-augmented release of these cytokines. Pretreatment with ALN augmented PamCSK-induced NF-κB activation in RAW-ASC cells and upregulated AP-1 activation. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) S protein and ALN synergically upregulated the release of IL-1α, IL-1β, IL-6 and TNF-α in RAW-ASC cells.

結論:

我々の知見は、ALNがMyD88発現のアップレギュレーションを介してTLR2リガンド誘導性の炎症性サイトカイン産生を増強し、この増強がRAW-ASC細胞におけるNF-κBおよびAP-1の活性化を伴っていることを示唆している。

CONCLUSIONS: Our findings suggest that ALN augments TLR2 ligand-induced proinflammatory cytokine production via the upregulation of MyD88 expression, and this augmentation is accompanied by the activation of NF-κB and AP-1 in RAW-ASC cells.