ProRoot MTA中の酸化ビスマスの溶出と細胞毒性 - 実験室での検討-

Leaching and cytotoxicity of bismuth oxide in ProRoot MTA - A laboratory investigation.

抄録

目的:

本研究では、ProRoot MTAからのビスマスの溶出と細胞毒性を調べ、ビスマスの溶出がセメントベースと使用した浸漬レジームに影響されるかどうかを明らかにすることを目的とした。

AIM: The present study examined the leaching and cytotoxicity of bismuth from ProRoot MTA and aimed to identify whether bismuth leaching was affected by the cement base and the immersion regime used.

方法:

ビスマスの溶出プロファイルをProRoot MTAから調べ、酸化ビスマスを20％含有するハイドロキシアパタイト、およびハイドロキシアパタイトとケイ酸三カルシウムと比較し、ビスマスの溶出がセメントベースによって変化するかどうかを調べた。ビスマスの溶出は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に浸漬して30日および180日経過後に、質量分析法（ICP-MS）を用いて測定した。培地は変化させないか、定期的に補充した。熟成材料のpH、表面微細構造、相変化を評価した。Wistarラット大腿骨骨髄間質細胞（BMSCs）および皮膚線維芽細胞を単離し、培養し、定期的に補充したDMEM中で非老化、30日および180日老化サンプルに暴露した後、細胞計数（トリパンブルー生死）のために播種した。BMSCsの培養には、材料と接触させた熟成DMEMも使用し、材料溶出物の細胞への影響を調べた。遺伝子発現解析は、細胞を非老化物質に直接暴露した後にも行われた。グループ間の差は、有意水準5%で統計的に検定した。

METHODOLOGY: The leaching profile of bismuth was examined from ProRoot MTA and compared with hydroxyapatite containing 20% bismuth oxide as well as hydroxyapatite and tricalcium silicate to investigate whether bismuth release changed depending on the cement base. Bismuth leaching was determined after 30 and 180 days of ageing immersed in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) using mass spectroscopy (ICP-MS). The media were either unchanged or regularly replenished. The pH, surface microstructure and phase changes of aged materials were assessed. Wistar rat femoral bone marrow stromal cells (BMSCs) and cutaneous fibroblasts were isolated, cultured and seeded for cell counting (trypan blue live/dead) after exposure to non-aged, 30- and 180-days-aged samples in regularly replenished DMEM. Aged DMEM in contact with materials was also used to culture BMSCs to investigate the effect of material leachates on the cells. Gene expression analysis was also carried out after direct exposure of cells to non-aged materials. Differences between groups were statistically tested at a significance level of 5%.

結果:

すべての材料がDMEMに浸漬した後に変化を示し、これは曝露時間が長いほど増加した。ICP-MSで検出されたように、ProRoot MTAからビスマスが溶出した。熟成したProRoot MTAサンプルは黒く変色し、表面に炭酸カルシウムが沈着した。プロルートMTAは、直接暴露後の細胞数に 影響を及ぼし、180日後の溶出物はBMSCの生存能 を低下させた。非老化プロルートMTAとBMSCが直接接触した後、メタロチオネイン（MT1およびMT2A）の発現のアップレギュレーションと、コラーゲン-1a（Col-1a）および骨サイアロタンパク質（BSP）の発現のダウンレギュレーションが確認された。

RESULTS: All materials exhibited alterations after immersion in DMEM and this increased with longer exposure times. The bismuth leached from ProRoot MTA as detected by ICP-MS. Aged ProRoot MTA samples exhibited a black discolouration and surface calcium carbonate deposition. ProRoot MTA influenced cell counts after direct exposure and its 180-days leachates reduced BMSC viability. After direct BMSC contact with non-aged ProRoot MTA an upregulation of metallothionein (MT1 and MT2A) expression and down-regulation of collagen-1a (Col-1a) and bone sialoprotein (BSP) expression was identified.

結論:

180日間の観察期間中、酸化ビスマスを含むすべての材料からビスマスの溶出が観察された。これは、ビスマス暴露に関連する細胞生存率および遺伝子発現に悪影響を及ぼした。これは、メタロチオネイン遺伝子の発現がProRoot MTAへの曝露に影響されたことを報告した最初の研究である。

CONCLUSIONS: Bismuth leaching was observed throughout 180-days observation period from all materials containing bismuth oxide. This negatively influenced cell viability and gene expression associated with bismuth exposure. This is the first study to report that metallothionein gene expression was influenced by exposure to ProRoot MTA.