破骨細胞：骨吸収と骨形成を制御する新規破骨細胞サブセット

Osteostaticytes: A novel osteoclast subset couples bone resorption and bone formation.

抄録

背景:

骨髄炎（OM）は、皮質骨の脈管減少と壊死を特徴とする骨の炎症性疾患である。骨リモデリングの調節障害はOMによって引き起こされる。骨リモデリングは、骨吸収と骨形成が反転期を経て正確に調整される。しかしながら、骨髄炎後の骨リモデリング不全の根底にある細胞および分子メカニズムは、いまだ解明されていない。

BACKGROUND: Osteomyelitis (OM) is an inflammatory condition of bone characterized by cortical bone devascularization and necrosis. Dysregulation of bone remodelling is triggered by OM. Bone remodelling is precisely coordinated by bone resorption and formation via a reversal phase. However, the cellular and molecular mechanisms underlying bone remodelling failure after osteomyelitis remain elusive.

方法:

骨髄炎後の骨治癒の基礎となる細胞および分子メカニズムを解明するために、正常、感染、再建状態のヒト皮質骨のアトラスを描くために、単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）を採用した。破骨細胞系列の詳細なクラスターを解析するために、t-stochastic neighbourhood embedding（t-SNE）による次元削減とグラフベースのクラスタリングを適用した。さらに、破骨細胞誘導モデルおよびヒト骨切片における破骨細胞系譜のマーカー遺伝子発現を同定するために、リアルタイムPCRおよび免疫蛍光染色をそれぞれ適用した。遺伝子セット濃縮解析（GSEA）とCellChatを用いて、破骨細胞の潜在的な機能とコミュニケーションを解析した。様々な分化状態にある間葉系幹細胞（MSC）と破骨細胞系細胞の走化能は、トランスウェルアッセイと共培養アッセイによって決定された。また、この共培養系を用いて、種々の破骨細胞系がMSCの骨形成分化能に及ぼす影響についても検討した。正常マウス脛骨骨折モデルと骨髄炎関連脛骨骨折モデルを作製し、ルシフェラーゼ標識した破骨細胞系譜とMSCの関係を検証した。その後、生物発光イメージングシステムにより感染を検出した。最後に、免疫蛍光染色を用いて、正常および感染骨再形成モデルにおける異なる再形成段階におけるMSCsおよび新規破骨細胞系譜のマーカー発現を検出した。

METHODS: To elucidate the cellular and molecular mechanism underlying bone healing after osteomyelitis, we employed single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) to depict the atlas of human cortical bone in normal, infected and reconstructed states. Dimensionality reduction by t-stochastic neighbourhood embedding (t-SNE) and graph-based clustering were applied to analyse the detailed clusters of osteoclast lineages. After trajectory analysis of osteoclast lineages over pseudotime, real-time PCR and immunofluorescence (IF) staining were applied to identify marker gene expression of various osteoclast lineages in the osteoclast induction model and human bone sections, respectively. The potential function and communication of osteoclasts were analysed via gene set enrichment analysis (GSEA) and CellChat. The chemotactic ability of mesenchymal stem cells (MSCs) and osteoclast lineage cells in various differentiation states was determined by transwell assays and coculture assays. The effects of various osteoclast lineages on the osteogenic differentiation potential of MSCs were also determined by using this coculture system. A normal mouse tibia fracture model and an osteomyelitis-related tibia fracture model were generated via injection of luciferase-labelled to verify the relationships between a novel osteoclast lineage and MSCs. Then, the infection was detected by a bioluminescence imaging system. Finally, immunofluorescence staining was used to detect the expression of markers of MSCs and novel osteoclast lineages in different remodelling phases in normal and infected bone remodelling models.

結果:

本研究では、正常骨、感染骨、再建皮質骨を網羅する細胞アトラスを構築した。そして、IDO1、CCL3、CCL4の発現増加を示す破骨細胞系列の初期段階にある新規サブセットを同定した。これらのIDO1CCL3CCL4細胞はオステオスタティサイト（OSCs）と呼ばれ、さらに逆転期の破骨細胞のリザーバーと考えられた。注目すべきは、OSCsが他の細胞系を凌駕する最高の走化性活性を示したことである。また、破骨細胞系譜の初期段階にある細胞は、間葉系幹細胞（MSC）のリクルートにおいて重要な役割を果たしていることも見いだした。最後に、OSCsは骨MSCsの発生と骨リモデリングの寄与に正の関係がある可能性が明らかになった。

RESULTS: In this study, we constructed a cell atlas encompassing normal, infected, and reconstructed cortical bone. Then, we identified a novel subset at the earlier stage of the osteoclast lineage that exhibited increased expression of IDO1, CCL3, and CCL4. These IDO1CCL3CCL4 cells, termed osteostaticytes (OSCs), were further regarded as the reservoir of osteoclasts in the reversal phase. Notably, OSCs exhibited the highest chemotactic activity, surpassing other lineage subsets. We also discovered that cells at the earlier stage of the osteoclast lineage play a significant role in recruiting mesenchymal stem cells (MSCs). Finally, the data revealed that OSCs might be positively related to the occurrence of bone MSCs and the contribution of bone remodelling.

結論:

以上の結果から、破骨細胞系譜の中にOSCという新たなステージが存在することが明らかとなった。OSCは、MSCに対する走化性能が高く、骨リモデリングに寄与する可能性があることから、とらえどころのない骨リバーサル細胞である可能性がある。本研究は、骨リモデリングにおける逆転期の複雑なメカニズムに関する貴重な知見を提供するとともに、骨結合不全に関連する疾患に対する治療戦略の可能性を明らかにするものである。

CONCLUSION: Collectively, our findings revealed a novel stage (OSC) within the osteoclast lineage, potentially representing elusive bone reversal cells due to its increased chemotactic ability towards MSCs and potential contribution to bone remodelling. This study provides valuable insights into the intricate mechanisms of the reversal phase during bone remodelling and unveils potential therapeutic strategies for diseases associated with bone uncoupling.

本論文のトランスレーショナルポテンシャル:

本研究は、IDO1（プラス記号）CCL3（プラス記号）CCL4（プラス記号）と呼ばれる破骨細胞系譜の中で最も高い走化性活性を示し、骨リモデリングにおける逆転細胞として機能する可能性のある新しいサブセットを同定した。これらの知見は、骨のリバーサルに関連する疾患を理解するための新たな知見と洞察を提供し、骨髄炎や骨治癒遅延などの病態に対する新たな治療標的となる可能性がある。

TRANSLATIONAL POTENTIAL OF THIS ARTICLE: This study identified a new subset, referred to as IDO1(plus symbol) CCL3(plus symbol) CCL4(plus symbol) osteostaticytes which displayed the highest chemotactic activity among all osteoclast lineages and may serve as reversal cells in bone remodelling. These findings offer new insights and insights for understanding bone reversal-related diseases and may serve as novel therapeutic targets for conditions such as osteomyelitis and delayed bone healing.