カルシウム感受性受容体はホスホイノシチド3-キナーゼ/Akt経路を介してin vitroでLPS処理ヒト歯髄細胞の血管新生分化を制御する

Calcium-sensing receptor regulates the angiogenic differentiation of LPS-treated human dental pulp cells via the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway in vitro.

抄録

目的:

本研究の目的は、リポ多糖（LPS）処理したヒト歯髄細胞（hDPC）の血管新生分化におけるカルシウム感受性受容体（CaSR）の役割を調べることである。

AIM: The purpose of this study was to investigate the role of calcium-sensing receptor (CaSR) in the angiogenic differentiation of lipopolysaccharide (LPS)-treated human dental pulp cells (hDPCs).

方法:

LPSで誘導されたhDPCを、CaSRアゴニストR568とアンタゴニストCalhex231の組み合わせを変えた培地で培養した。細胞増殖、遊走、血管新生能は、それぞれCell Counting Kit-8 (CCK-8)、スクラッチ創傷治癒、チューブ形成アッセイで測定した。酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）、ウェスタンブロットを行い、CaSR、炎症メディエーター、血管新生関連マーカーの遺伝子/蛋白発現を測定した。ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）とプロテインキナーゼB（Akt）の活性化はウェスタンブロット分析で評価した。

METHODOLOGY: The LPS-induced hDPCs were cultured in the medium with different combinations of CaSR agonist R568 and antagonist Calhex231. The cell proliferation, migration, and angiogenic capacity were measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8), scratch wound healing, and tube formation assays, respectively. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), and western blot were conducted to determine the gene/protein expression of CaSR, inflammatory mediators, and angiogenic-associated markers. The activation of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and protein kinase B (Akt) was assessed by western blot analysis.

結果:

細胞増殖はR568またはCalhex231の曝露に反応して上昇したが、細胞遊走の亢進はCalhex231を添加した培養でのみ認められた。さらに、R568は血管様構造の形成を促進し、腫瘍壊死因子(TNF)-α、血管内皮増殖因子(VEGF)、間質細胞由来因子(SDF)-1のタンパク質発現を上昇させることがわかった。同様の影響は、PI3K阻害剤LY294002存在下でのR568刺激細胞でも観察された。対照的に、Calhex231は、IL-6、TNF-α、eNOSの産生を促進する一方で、チューブ形成とVEGFタンパク質レベルを明らかに阻害した。しかし、LY294002存在下では、Calhex231はCaSR、VEGF、SDF-1のタンパク質発現を有意に促進した。さらに、R568はAktのリン酸化を促進する作用を示したが、これはLY294002によって逆転させることができた。

RESULTS: The cell proliferation was elevated in response to R568 or Calhex231 exposure, but an enhanced cell migration was only found in cultures supplemented with Calhex231. Furthermore, R568 was found to potentiate the formation of vessel-like structure, up-regulated the protein expression of tumour necrosis factor (TNF)-α, vascular endothelial growth factor (VEGF), and stromal cell-derived factor (SDF)-1; comparable influences were also observed in R568-stimulated cells in the presence of PI3K inhibitor LY294002. In contrast, Calhex231 obviously inhibited the tube formation and VEGF protein level, whereas promoted the production of IL-6, TNF-α, and eNOS; however, in the presence of LY294002, Calhex231 showed a significant promotion on the protein expression of CaSR, VEGF, and SDF-1. In addition, R568 exhibited a promotive action on the Akt phosphorylation, which can be reversed by LY294002.

結論:

我々の結果は、CaSRがPI3K/Aktシグナル伝達経路の関与により、LPS処理hDPCsの血管新生分化を制御できることを示した。

CONCLUSIONS: Our results demonstrated that CaSR can regulate the angiogenic differentiation of LPS-treated hDPCs with an involvement of the PI3K/Akt signalling pathway.