ヒト糞便サンプル中の細菌株を高精度かつ高感度に絶対定量する

Highly accurate and sensitive absolute quantification of bacterial strains in human fecal samples.

抄録

背景:

次世代シーケンス（NGS）アプローチは腸内細菌叢研究に革命をもたらし、菌株レベルの解像度を提供することができるが、これらの技術には、半定量的であること、高い検出限界に悩まされること、組成的なデータを生成することなどの限界がある。本研究では、ヒト糞便サンプル中のリモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）株を絶対定量するための定量的PCR（qPCR）と液滴デジタルPCR（ddPCR）を系統的に比較し、糞便サンプル中の細菌株を絶対定量するための最適化されたプロトコルを開発することを目的とした。

BACKGROUND: Next-generation sequencing (NGS) approaches have revolutionized gut microbiome research and can provide strain-level resolution, but these techniques have limitations in that they are only semi-quantitative, suffer from high detection limits, and generate data that is compositional. The present study aimed to systematically compare quantitative PCR (qPCR) and droplet digital PCR (ddPCR) for the absolute quantification of Limosilactobacillus reuteri strains in human fecal samples and to develop an optimized protocol for the absolute quantification of bacterial strains in fecal samples.

結果:

L. reuteri 17938の菌株特異的PCRプライマーを使用した場合、ddPCRの方が若干再現性が高かったが、qPCRはほぼ同等の再現性を示し、キットベースのDNA分離法を使用した場合、同等の感度（検出限界[LOD]は約10個/g糞便）と直線性（R>0.98）を示した。さらに、qPCRの方がダイナミックレンジが広く、安価で迅速であった。これらの結果から、糞便サンプル中の細菌株の絶対定量には、ddPCRよりもqPCRの方が有利であると結論した。ゲノム配列からのプライマー設計からPCRシステムのキャリブレーションに至るまで、菌株特異的qPCRアッセイを設計するための最適化されたステップバイステップの簡単なプロトコルを提供する。このプロトコールをL. reuteriのPB-W1株とDSM 20016株のPCRアッセイに適用した結果、高精度のqPCRが得られ、スパイクされた糞便サンプル中の検出限界は約10cells/g fecesであった。ヒト試験中に生きたL. reuteri PB-W1株またはDSM 20016株を投与されたヒト被験者から採取した糞便サンプルに我々の株特異的qPCRアッセイを適用したところ、NGSアプローチ（16S rRNA遺伝子シーケンスおよび全メタゲノムシーケンス）と比較して、LODがはるかに低く、ダイナミックレンジが広く、これら2株の高精度定量および高感度検出が実証された。

RESULTS: Using strain-specific PCR primers for L. reuteri 17938, ddPCR showed slightly better reproducibility, but qPCR was almost as reproducible and showed comparable sensitivity (limit of detection [LOD] around 10 cells/g feces) and linearity (R > 0.98) when kit-based DNA isolation methods were used. qPCR further had a wider dynamic range and is cheaper and faster. Based on these findings, we conclude that qPCR has advantages over ddPCR for the absolute quantification of bacterial strains in fecal samples. We provide an optimized and easy-to-follow step-by-step protocol for the design of strain-specific qPCR assays, starting from primer design from genome sequences to the calibration of the PCR system. Validation of this protocol to design PCR assays for two L. reuteri strains, PB-W1 and DSM 20016, resulted in a highly accurate qPCR with a detection limit in spiked fecal samples of around 10 cells/g feces. Applying our strain-specific qPCR assays to fecal samples collected from human subjects who received live L. reuteri PB-W1 or DSM 20016 during a human trial demonstrated a highly accurate quantification and sensitive detection of these two strains, with a much lower LOD and a broader dynamic range compared to NGS approaches (16S rRNA gene sequencing and whole metagenome sequencing).

結論:

今回の分析結果から、キットベースのDNA抽出アプローチを用いたqPCRは、糞便サンプル中の腸内細菌を菌株レベルで正確に定量するための最良のアプローチであると考えられる。提供されたステップバイステップのプロトコールにより、科学者はL. reuteriだけでなく、他の細菌分類群の細菌株を幅広いアプリケーションやサンプルタイプで正確に定量するための高感度株特異的PCRシステムを設計することができる。ビデオの要約

CONCLUSIONS: Based on our analyses, we consider qPCR with kit-based DNA extraction approaches the best approach to accurately quantify gut bacteria at the strain level in fecal samples. The provided step-by-step protocol will allow scientists to design highly sensitive strain-specific PCR systems for the accurate quantification of bacterial strains of not only L. reuteri but also other bacterial taxa in a broad range of applications and sample types. Video Abstract.