T4 DNAポリメラーゼによる(Sp)-dATPαSのテンプレートプライム依存性ターンオーバー。関連する3'の立体化学は5'-エキソヌクレアーゼに行く

Template-prime-dependent turnover of (Sp)-dATP alpha S by T4 DNA polymerase. The stereochemistry of the associated 3' goes to 5'-exonuclease.

• A Gupta
• C DeBrosse
• S J Benkovic

抄録

T4 DNAポリメラーゼは、ポリ(d(A-T).ポリ(d(A-T))テンプレートプライマーの存在下で、(Sp)-2'-デオキシアデノシン5'-O-(1-チオ[1-18O2]三リン酸)を2'-デオキシアデノシン5'-O-[18O]-ホスホロチオエートに変換する。ポリ(d(A-T).ポリ(d(A-T)テンプレートプライマーを省略するか、または(Rp)-2'-デオキサアデノシン5'-O-(1-チオトリホスフェート)ジアステレオマーを用いた対照実験では、反応は認められなかった。したがって、この変換は、P--Oの場合と同様に、チオヌクレオチドのポリ(d(A-T)への組み込みと、3'が5'エキソヌクレアーゼ活性に行く結果として生じる加水分解を伴うものと推測される。2'-デオキシアデノシン5'-O-[18O]ホスホロチオエートは、結合したアデニル酸キナーゼ-ピルビン酸キナーゼ酵素系を用いて、Pαでの構成の変化を伴わずに、(Sp)-2'-デオキシアデノシン5'-O-(1-チオ[1-18O]トリホスフェート)に変換された。生成物の31P NMRスペクトルは、18Oが完全に非架橋位置にあることを示し、正味のターンオーバー過程（すなわち、組み込みに続いて切除）で全体的に保持されていることを示した。組込みプロセスは、リンの周りの構成の反転を伴うので（Romaniuk, P. J., and Eckstein, F. (1982) J. Biol.Chem.257, 7684-7688）から、T4ポリメラーゼの3' goes to 5'-exonuclease活性は、最も単純に直接的な変位機構を介して、リン原子での配置の反転を伴って進行することが推論されなければなりません。この発見は、共有結合性ホスホリル酵素中間体を介さないエキソヌクレアーゼによって触媒されたホスホジエステル加水分解の最初の例を表しています(Knowles, J. R. (1980) Annu.Rev. Biochem.49, 877-919).

T4 DNA polymerase converts (Sp)-2'-deoxyadenosine 5'-O-(1-thio[1-18O2]triphosphate) to 2'-deoxyadenosine 5'-O-[18O]-phosphorothioate in the presence of poly(d(A-T).poly(d(A-T)) template-primer. Control experiments involving either omitting the poly(d(A-T)).poly(d(A-T) template-primer or employing the (Rp)-2'-deoxyadenosine 5'-O-(1-thiotriphosphate) diastereomer showed no reaction. It is assumed, therefore, that this conversion as in the P--O case involves incorporation of the thionucleotide into the poly(d(A-T)) followed by hydrolysis resulting from the 3' goes to 5'-exonuclease activity. The 2'-deoxyadenosine 5'-O-[18O] phosphorothioate was converted to (Sp)-2'-deoxyadenosine 5'-O-(1-thio[1-18O]triphosphate), with no change in the configuration at P alpha by using the coupled adenylate kinase-pyruvate kinase enzyme system. A 31P NMR spectrum of the product showed that the 18O was entirely in the nonbridging position, indicating an overall retention in the net turnover process (i.e. incorporation followed by excision). Since the incorporation process involves an inversion of configuration around the phosphorus (Romaniuk, P. J., and Eckstein, F. (1982) J. Biol. Chem. 257, 7684-7688), it must be inferred that the 3' goes to 5'-exonuclease activity of T4 polymerase proceeds with inversion of configuration at the phosphorus atom, most simply via a direct displacement mechanism. This finding represents the first example of phosphodiester hydrolysis catalyzed by an exonuclease that does not involve a covalent phosphoryl-enzyme intermediate (Knowles, J. R. (1980) Annu. Rev. Biochem. 49, 877-919).