6-メルカプト-GTPとウシ脳チューブリンの相互作用。平衡の側面

Interaction of 6-mercapto-GTP with bovine brain tubulin. Equilibrium aspects.

• J L Fishback
• L R Yarbrough

抄録

グリセロールの存在下で、チオヌクレオチド２-アミノ-６-メルカプト-９-リボフラノシルプリン５'-三リン酸（Ｓ６-ＧＴＰ）は、微小管を形成するための６Ｓチューブリンの集合を促進する。このアナログで組み立てられた微小管は、通常の安定性特性を示す。グリセロールの非存在下では、いくつかの微小管は、S6-GTPで形成されている;しかし、多くのねじれたリボンは明らかである。関連するタンパク質と交換可能なヌクレオチドが除去されたチューブリンへのS6-GTPの結合（Tu(-)）は、約16％の本質的なチューブリンの蛍光の消光を生成します。蛍光滴定は、約3 X 10(-8)MのチューブリンS6-GTP複合体の見かけのKdを示しています。S6-GTPがTu(-)に結合すると、その吸収スペクトルにも変化が生じた。観察された差分スペクトルは、350nmに最大値を持ち、323と338nmに負の極値を持つ。このことは、チオグアニン環の環境が比較的疎水性であることを示唆している。競争的な変位研究は、GTPのための約1.7 X 10(-8)MとGDPのための8.3 X 10(-8)Mの見かけのKdの値を得ることができます。結合に伴う吸光度と蛍光の変化は、ヌクレオチド結合の速度論とメカニズムの研究だけでなく、GTP、GDP、およびそれらのアナログの置換の速度論の研究にも優れたアプローチを提供します。

In the presence of glycerol, the thionucleotide 2-amino-6-mercapto-9-ribofuranosyl purine 5'-triphosphate (S6-GTP) promotes the assembly of 6 S tubulin to form microtubules. Microtubules assembled with this analog show normal stability properties. In the absence of glycerol, few microtubules are formed with S6-GTP; however, many twisted ribbons are evident. Binding of S6-GTP to tubulin from which the associated proteins and exchangeable nucleotide have been removed (Tu(-] produces about a 16% quenching of intrinsic tubulin fluorescence. Fluorescence titrations indicate an apparent Kd for the tubulin S6-GTP complex of about 3 X 10(-8)M. Binding of S6-GTP to Tu(-) also produces a change in its absorption spectrum. The observed difference spectrum has a maximum at 350 nm and negative extrema at 323 and 338 nm. This suggests that the environment of the thioguanine ring is relatively hydrophobic. Competitive displacement studies yield apparent Kd values of about 1.7 X 10(-8)M for GTP and 8.3 X 10(-8) M for GDP. The changes in absorbance and fluorescence which accompany binding provide an excellent approach to the study of the kinetics and mechanisms of nucleotide binding as well as studies of the kinetics of displacement of GTP, GDP, and their analogs.