二染色体蛍光in situハイブリダイゼーションで検出されたマウスの後期精子体の異数性

Aneuploidy in late-step spermatids of mice detected by two-chromosome fluorescence in situ hybridization.

• A Wyrobek
• X Lowe
• D Pinkel
• J Bishop

抄録

これらのプローブは、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識したヌクレオチドでニック翻訳し、FITCまたはローダミンで検出した。プローブとハイブリダイゼーションの特異性は、一次および二次精子細胞だけでなく、脾臓および骨髄細胞のメタフェース染色体を用いて確認した。また、X染色体と8番染色体のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行ったところ、約50%、99%以上の細胞でコンパクトな蛍光ドメインが確認されました。健康な若年成人C57BL/6またはB6C3F1マウス8匹から採取した80,000個以上の後期精子を調査したところ、約3/10,000個の精子は、X-Xまたは8-8染色体の多倍体化を示す蛍光表現型を有していました。これらの頻度は、マウスの減数分裂メタフェースIIおよび第一切断メタフェースにおける異数性の頻度が公表されているものと一致しており、異数性の検出のための精子ハイブリダイゼーションの予備的な検証を提供している。また、有意な動物差や系統差は認められなかった。さらに、マウス精子の多倍体化頻度は、同様のハイブリダイゼーション法で得られた健康な男性の精子と区別がつかなかった。これらの方法で男性配偶子の異倍体を検出することは、ヒトと動物の研究の間の「架け橋となるバイオマーカー」の一例である。これらは、父方由来の異常な生殖結果をもたらす遺伝学的、生殖学的、毒物学的要因の研究への応用が期待されています。

A multicolor procedure employing fluorescence in situ hybridization is described for detecting chromosomal domains and germinal aneuploidy in late-step spermatids in mice using DNA probes specific for repetitive sequences near the centromeres of chromosomes 8 and X. These probes were nick-translated with biotin- or digoxigenin-labeled nucleotides, and were detected with FITC or rhodamine. Probe and hybridization specificities were confirmed using metaphase chromosomes from spleen and bone marrow cells as well as from primary and secondary spermatocytes. Late-step spermatids, identified in testicular preparations by their hooked shape, yielded compact fluorescence domains in approximately 50% and > 99% of cells when hybridized with probes for chromosomes X and 8, respectively. In a survey of > 80,000 late-step spermatids from 8 healthy young adult C57BL/6 or B6C3F1 mice, approximately 3/10,000 spermatids had fluorescence phenotypes indicative of X-X or 8-8 hyperhaploidy. These frequencies are consistent with published frequencies of aneuploidy in meiotic metaphase II and first cleavage metaphases of the mouse, providing preliminary validation of sperm hybridization for the detection of aneuploidy. No significant animal or strain differences were observed. In addition, the hyperhaploidy frequencies for murine spermatids were indistinguishable for those for sperm from healthy men obtained by a similar hybridization procedure. These procedures for detecting aneuploid male gametes are examples of "bridging biomarkers" between human and animal studies. They have promising applications for investigations of the genetic, reproductive, and toxicological factors leading to abnormal reproductive outcomes of paternal origin.